[發明專利]重組單鏈負義植物病毒侵染性克隆構建方法及質粒和病毒

有效

• 申請號: 201510371359.4
• 申請日: 2015-06-30
• 公開（公告）號: CN105039388B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 李正和;王強;馬曉楠;錢莎莎;孫凱;周雪平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;C12N7/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種重組單鏈負義植物病毒侵染性克隆構建方法，其特征在于：在植物細胞中導入質粒載體的混合物，所述混合物包括（i）一種轉錄載體，所述轉錄載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子中含有編碼屬于植物彈狀病毒的苦苣菜黃網病毒（SYNV）的多核苷酸序列，（ii）至少一種表達載體，包括編碼所述SYNV衣殼包裝、轉錄和復制所必需的反式作用蛋白的多核苷酸序列，和（iii）另一種表達載體，包含煙草蝕紋病毒Hc-Pro基因、番茄叢矮病毒的p19基因和大麥條紋花葉病毒gb基因的多核苷酸序列；所述的質粒載體導入植物細胞的過程是在足以實現所述的所有質粒載體同時轉錄或共表達和產生重組病毒的條件下進行的。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，（i）中所述的多核苷酸序列為SYNV反基因組序列和（ii）中所述的SYNV衣殼包裝、轉錄和復制所必需的反式作用蛋白為SYNV病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的煙草蝕紋病毒的Hc-Pro 基因、番茄叢矮病毒的p19 基因和大麥條紋花葉病毒的gb 基因的多核苷酸序列編碼植物RNA沉默抑制子蛋白。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述編碼SYNV的反基因組的分離核酸分子編碼具有侵染活性的病毒。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉錄載體和表達載體利用RNA聚合酶II型啟動子。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的載體導入植物細胞的途徑包括農桿菌浸潤和基因槍轟擊；所述的植物細胞是指植株葉、莖、根和花器的細胞，或離體培養細胞和原生質體。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步，還包括在植物細胞內獲得所述重組病毒。

8.用于如權利要求1所述方法的質粒，其特征在于，包括編碼所述SYNV多核苷酸序列的轉錄載體，編碼所述SYNV衣殼包裝、轉錄和復制所必需的反式作用蛋白的多核苷酸序列的表達載體，以及包含所述煙草蝕紋病毒Hc-Pro基因、番茄叢矮病毒的p19基因和大麥條紋花葉病毒gb基因的多核苷酸序列的表達載體。

9.一種如權利要求1所述的方法獲得的重組病毒，其特征在于，所述的重組病毒反基因組第11961位堿基由野生型病毒的腺嘌呤核苷酸突變為鳥嘌呤核苷酸，形成了可被限制性內切酶Bsmb I識別的分子標記。