[發(fā)明專利]用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510368787.1
• 申請(qǐng)日: 2015-03-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105181560B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: I·海德曼;M·迪貝拉爾迪諾;K·科克;G·沙德-坎普曼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安弗西斯股份公司
• 主分類號(hào): G01N15/14
• 分類號(hào): G01N15/14
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李慧惠;黃希貴

本發(fā)明涉及用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，所述方法包括：從花中機(jī)械移取花粉粒；在導(dǎo)電的緩沖液中重懸花粉粒，用于使植物細(xì)胞保持活性；將花粉懸浮液通過(guò)具有適合于微流體設(shè)備的孔徑的適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器，所述微流體設(shè)備適配于實(shí)施阻抗式流式細(xì)胞術(shù)(IFC)；將過(guò)濾的懸浮液通過(guò)微流體設(shè)備并測(cè)量花粉粒的阻抗；存儲(chǔ)測(cè)量的各花粉的阻抗值以及測(cè)量頻率，所述阻抗值具有幅值及其相關(guān)相位角；計(jì)數(shù)過(guò)濾的懸浮液中的花粉粒；以及根據(jù)振幅和/或相位值，通過(guò)設(shè)定合適的門控以鑒別花粉粒，并確定分析的花粉群的活力比或成熟度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是植物細(xì)胞不必染色用于活力分析，該方法是非侵入式的，并且可以在短時(shí)間范圍內(nèi)實(shí)時(shí)且原地分析大量細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于確定花粉群的花粉活力和/或成熟度的方法，以及微流體設(shè)備的用途，所述微流體設(shè)備包括至少一個(gè)特定微流體芯片并且適配于用交流電(AC)實(shí)施阻抗式流式細(xì)胞術(shù)(IFC)。

背景技術(shù)

細(xì)胞活力的分析，特別是花粉粒的細(xì)胞活力的分析，在植物育種以及通過(guò)種子的植物產(chǎn)生過(guò)程的各個(gè)方面扮演重要角色。

未成熟的花粉粒(小孢子)的活力的分析對(duì)于純合的親本系的產(chǎn)生及其特定方案或方法的開(kāi)發(fā)是重要的。從花粉粒中產(chǎn)生親本系使得育種循環(huán)的許多代安全，并因此被認(rèn)為對(duì)于有效親本系產(chǎn)生是至關(guān)重要的。然而，為了這些系的最佳產(chǎn)生，它們的供體植物必須在最佳條件下生長(zhǎng)。

花粉質(zhì)量的分析在雄性不育母系的選擇期間扮演重要角色。基于只通過(guò)雌性遺傳的細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的雄性不育母系的使用，不僅在蟲(chóng)媒和風(fēng)媒授粉物種中是優(yōu)選的，而且在人工授粉物種中也是優(yōu)選的。由于花粉丟失，雄性不育母系不能自授粉，這防止了F1種子被母系材料污染，并且具有可以省去勞動(dòng)密集型去雄步驟的優(yōu)點(diǎn)。

高質(zhì)量的花粉對(duì)于有效的F1雜交種子的產(chǎn)生至關(guān)重要。高花粉質(zhì)量將帶來(lái)最大結(jié)籽率(seed set)，而較低的質(zhì)量將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量，并因此導(dǎo)致每粒種子的更高生產(chǎn)成本。花粉質(zhì)量受其遺傳組成、植株生長(zhǎng)條件的影響，但也受殺蟲(chóng)劑的影響。在產(chǎn)生過(guò)程之前和產(chǎn)生過(guò)程期間施用殺蟲(chóng)劑以保持結(jié)果植物(fruit-bearing plants)健康是常規(guī)實(shí)踐，因?yàn)檫@可以在可以分別收獲果實(shí)和種子之前的長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月開(kāi)始。因此，花粉的活力應(yīng)該在種子產(chǎn)生期間被持續(xù)監(jiān)測(cè)，分別以預(yù)示/預(yù)測(cè)和控制產(chǎn)生，以估計(jì)授粉的最佳時(shí)間點(diǎn)，例如，施用殺蟲(chóng)劑之后，或者測(cè)試哪種殺蟲(chóng)劑是不合適的，或者檢查其他化學(xué)制品(例如，化肥)的效果，或者生長(zhǎng)情況。

育種和F1雜交種子產(chǎn)生以及種質(zhì)保存程序中的另一種常規(guī)實(shí)踐是使用儲(chǔ)存的花粉進(jìn)行。對(duì)于任何儲(chǔ)存程序，應(yīng)該使用最高質(zhì)量的花粉。該領(lǐng)域中的常規(guī)花粉活力分析將允許儲(chǔ)存方案和后續(xù)過(guò)程的優(yōu)化。

當(dāng)前，不存在有效、高通量且容易實(shí)施的技術(shù)來(lái)原地(on-site)分析花粉質(zhì)量。

通常，通過(guò)各種經(jīng)典方法，如染色技術(shù)或者體外萌發(fā)測(cè)定來(lái)確定花粉活力。然而，來(lái)自各種染色技術(shù)的結(jié)果不總是與體外萌發(fā)相關(guān)，并且其不適用于所有物種。該染色技術(shù)基于酶促反應(yīng)，該酶促反應(yīng)可能不是在所有植物物種的花粉中存在，并且體外花粉萌發(fā)高度取決于正確的條件，該條件需要單獨(dú)調(diào)整。現(xiàn)有分析花粉活力和萌發(fā)的方法均受限于在特定時(shí)間范圍內(nèi)可以分析的細(xì)胞的數(shù)量，并且它們?cè)谥苽浜头治鲋惺呛臅r(shí)的。

另外，當(dāng)前技術(shù)接下來(lái)需要特定的化學(xué)制品，各種特定設(shè)備，如，熒光顯微鏡、培養(yǎng)箱，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員。通常，這意味著這些分析在分析實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，而不能在溫室或曠野的植物之間“原地”實(shí)施。最終，由于這些分析實(shí)施起來(lái)相當(dāng)復(fù)雜并且涉及從樣品制備到分析的數(shù)個(gè)易錯(cuò)步驟，所以它們的再現(xiàn)性在跨越整個(gè)種子產(chǎn)生過(guò)程的不同位置(即急需這些數(shù)據(jù)的不同地點(diǎn))變化巨大。因此，經(jīng)驗(yàn)顯示，在不同地理位置和甚至在密切相關(guān)的分析實(shí)驗(yàn)室中獲得的花粉活力數(shù)據(jù)也不總是可比較的，并且遭受主觀誤差。