[發明專利]一種肺癌輻射抗性細胞株的構建方法在審

申請號：	201510367859.0	申請日：	2015-06-29
公開（公告）號：	CN104962548A	公開（公告）日：	2015-10-07
發明（設計）人：	姚元虎;章龍珍;邱祥南;張偉;李浩;覃朝暉	申請（專利權）人：	徐州醫學院
主分類號：	C12N13/00	分類號：	C12N13/00;C12N5/09;C12R1/91
代理公司：	徐州市淮海專利事務所 32205	代理人：	華德明
地址：	221004 ***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種肺癌輻射抗性細胞株構建方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體地說是涉及一種具有穩定輻射抗性的肺癌輻射抗性細胞株的構建方法。

背景技術

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，2014年國家癌癥中心發布《中國腫瘤登記年報》報道，肺癌在我國惡性腫瘤中發病率居第一位，每年新發病例約60萬，死亡病例約49萬。放射治療是目前肺癌多學科綜合治療的重要手段之一，統計顯示超過70％的患者在診療過程中要接受放射治療。然而，雖經各種手段綜合治療，肺癌療效總體差強人意，5年生存率長期徘徊于15％左右，亟待改善。腫瘤復發和轉移是肺癌放射治療失敗的主要原因，現有研究認為，肺癌放射治療后殘留細胞，即肺癌輻射抗性細胞侵襲力和轉移活性增強，是腫瘤復發和轉移的根源。因此，構建肺癌輻射抗性細胞體外模型，對提高肺癌治療療效具有重要意義。

目前用于構建肺癌輻射抗性細胞的方法主要有小劑量等分割照射法和亞致死劑量照射法，其中小劑量等分割照射法因照射次數較多、構建周期需一年以上，細胞污染幾率大，穩定傳代成系較難。亞致死劑量照射法是采用使肺癌細胞DNA單鏈斷裂的亞致死劑量1次性照射，例如分別給予肺癌A549和H1299細胞亞致死劑量6.5Gy和5.5Gy的1次性照射。但目前臨床常規劑量分割放射治療總劑量應不低于60Gy，亞致死劑量照射法與現有臨床放療模式相差較大，因此采用此法構建的肺癌輻射抗性細胞無法最大限度模擬臨床復發癌放射生物學特性。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有穩定輻射抗性的肺癌輻射抗性細胞株的構建方法，照射次數少，構建周期短，細胞污染幾率小，構建的輻射抗性細胞株能模擬臨床復發癌放射生物學特性。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種肺癌輻射抗性細胞株的構建方法，包括以下步驟：

①將肺癌細胞置于37℃、5％CO₂培養箱內常規培養，當其覆蓋培養瓶60～70％并處于對數生長期時，接種于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆蓋1.5cm厚的組織等效填充物，照射源為醫用直線加速器，6MV-X線，機架旋轉180°，在室溫條件下射線從下方垂直入射，劑量率300cGy/min，源皮距SSD＝100cm，第1次予以2Gy照射；

②照射后更換新鮮培養基，待細胞覆蓋培養瓶80％以上時，胰酶消化，傳代兩次以上；

③傳代后置于37℃、5％CO₂培養箱內培養2～3天，待細胞再次覆蓋培養瓶60～70％后，再次給予2Gy照射；

④每一次照射后的細胞均按上述步驟②和步驟③的方法傳代并培養至穩定狀態后再進行照射，依次增加照射劑量達4Gy、6Gy、8Gy和10Gy，每劑量均照射2次，總劑量達60Gy，繼續培養及傳代5代以上至細胞形態、增殖穩定，凍存備用。

進一步，所述六孔板中每孔細胞接種量為5×10⁵個。

進一步，所述醫用直線加速器為Varian?23-EX醫用直線加速器。

進一步，所述X線的照射野大小為30cm×30cm。

本發明的技術方案有如下有益效果：

1、利用本發明構建肺癌輻射抗性細胞株，總共進行射線照射10次，照射次數少；構建周期約6個月，時間短；且因細胞從細胞無菌培養室外置于放射治療室的次數較少，細胞污染幾率小，優于小劑量等分割照射法；

2、集落形成實驗是目前國際公認的檢測細胞輻射抗性的金標準。本發明采用集落形成實驗檢測細胞的輻射抗性，結果表明采用本發明構建的肺癌輻射抗性細胞株的平均致死量D₀、準閾劑量Dq和2Gy生存分數SF₂均高于亞致死劑量照射法，即采用本發明構建肺癌輻射抗性細胞株的輻射抗性高于亞致死劑量照射法；

3、本發明照射總劑量為60Gy，與現有臨床放療模式相近，構建的輻射抗性細胞株能最大限度模擬臨床復發癌放射生物學特性。

附圖說明

圖1為本發明構建方法的流程圖；