[發明專利]一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法在審

申請號：	201510367541.2	申請日：	2015-06-29
公開（公告）號：	CN104962531A	公開（公告）日：	2015-10-07
發明（設計）人：	姜瞻梅;許曉曦;劉麗麗;辛巖	申請（專利權）人：	東北農業大學
主分類號：	C12N9/08	分類號：	C12N9/08
代理公司：	北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139	代理人：	孫皓晨
地址：	150030 黑龍***	國省代碼：	黑龍江;23
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種采用超濾輔助硫酸銨鹽提取過氧化物方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種提取乳過氧化物酶的方法，特別涉及一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法，本發明屬于乳過氧化物酶的提取制備技術領域。

背景技術

乳過氧化物酶(lactoperoxidase，以下簡稱LP)是動物乳中分泌的一種氧化還原酶，并在保護哺乳期乳腺和預防新生嬰兒的腸道病原微生物扮演著一個重要的角色，LP能夠催化內源的硫氰酸鹽(SCN-)氧化成具有抗菌性的硫氰酸鹽(OSCN-)。牛乳中存在的乳過氧化物酶，它能夠使鹵化物氧化或在過氧化氫存在下氧化硫氰酸鹽而形成抗菌介質。乳過氧化物酶攜帶Fe³⁺-血紅素蛋白，它存在于哺乳動物生物液體，如牛奶，唾液和眼淚中。LP分子量為85kDa，等電點為8.0-8.5，在pH值為6.5時LP帶正點，其在乳清中的含量為10-30mg/L。

乳過氧化物酶體系在食品行業中應用最廣泛的是乳制品，在過去幾十年里國內外有大量從乳中提取LP的方法有色譜技術、膜色譜等，色譜技術應用有離子交換，分子篩，免疫親和色譜，膜色譜應用較多的是離子交換吸附膜。雖然傳統這些色譜法提取LP純度較高，但是仍有很多缺點例如耗時較長，回收率較低及成本昂貴，并不適宜大量生產乳過氧化物酶。想要高效率的從牛乳清中提取LP并不是一個簡單的任務，因為乳清中存在大量的雜蛋白給分離帶來了困難，因此從乳清中分離LP迫切的需要一個效率高、成本低、開發潛力大的方法。

鹽析沉淀法是酶分離純化過程中最常用的方法,其原理是在高濃度的鹽溶液中,大量鹽離子使水濃度相對降低，蛋白質水化作用減弱，相互凝聚沉淀出來，由于蛋白質水化作用與蛋白質本身的分子量、等電點等物化常數有關，所以不同蛋白質在不同鹽析條件下的析出程度也不同，從而達到分離目的。鹽析法具有成本低、不需要昂貴設備、操作簡單安全等特點，適用范圍十分廣泛。國內有關于用硫酸鹽析法分離大豆酸沉蛋白和羔羊皺胃酶的報道，但是還沒有報道用其分離乳過氧化物酶的。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術缺陷，提供一種可以用于工業化生產高回收率和純化倍數可用于食品工業的乳過氧化物酶提取方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

以牛乳清為原料，以硫酸銨鹽析法為提取手段，確定硫酸銨鹽析法中最佳鹽析條件下飽和度、鹽析時間、最佳轉速、體系pH的工藝條件，并比較了硫酸銨鹽分級沉淀與直接一次用65％硫酸銨飽和度對LP酶活回收率和純化倍數的影響。采用超濾技術進行進一步純化，最后透析脫鹽和冷凍干燥制得成品，即原料乳清→硫酸銨鹽析法分級沉淀提取乳過氧化酶→沉淀溶解→溶液使用超濾分離→收集截留溶液→透析脫鹽→冷凍干燥→乳過氧化物酶粗產品。

具體的，本發明的一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法，包含以下步驟：

(1)硫酸銨鹽析法分級提取乳過氧化物酶：

除去新鮮的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室溫條件下，向乳清中添加25-85％飽和度的硫酸銨，離心，去除沉淀，置于攪拌器上不斷攪拌使硫酸銨充分溶解，調節體系pH到5.5-8.5，放置2-10h使乳過氧化物酶完全沉淀，4℃5000-10000r/min離心20min到沉淀即為乳過氧化物酶制品；

(2)超濾：

將步驟(1)中得到的沉淀使用適量去離子水復溶用超濾膜進行超濾分離，以除去雜蛋白，收集截留溶液；

(3)脫鹽處理：

將步驟(2)收集的截留溶液裝入透析袋內進行脫鹽；

(4)干燥：

將步驟(3)脫鹽溶液冷凍干燥即制得乳過氧化物酶粗制品。

在本發明中，優選的，所述步驟(1)中使用硫酸銨飽和度為65％。

在本發明中，優選的，所述步驟(1)中使用硫酸銨分級沉淀鹽析，具體為使用先用飽和度25-35％的硫酸銨鹽析，離心，去除沉淀，上清液中繼續加硫酸銨至終飽和度為55-70％。

在本發明中，優選的，所述步驟(1)中使用先用飽和度30％的硫酸銨鹽析，離心，去除沉淀，上清液中繼續加硫酸銨至終飽和度為65％。