[發明專利]一種重組細菌素及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510367534.2
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104962566B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 于微;張明輝;高學軍;王琦
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/245
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

本發明涉及一種重組細菌素及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。本發明重組細菌素LacAB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重組表達載體pGEX?4T?1?LacAB包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發明將含有重組表達載體pGEX?4T?1?LacAB的大腸桿菌BL21經IPTG誘導目的蛋白表達，收集菌液，提取菌液中的重組蛋白，得到的重組蛋白溶液通過GST純化柱，GST標簽和柱子上的GST親和蛋白結合，通過洗脫液得到純化的GST?LacAB蛋白，用凝血酶切除GST標簽后，用GST純化試劑盒純化，得到單一的重組細菌素LacAB。本發明的重組細菌素抗菌活性及穩定性好，抑菌譜廣，可作為理想的抗生素替代品和人畜生物性藥物、飼料添加劑、防腐劑、消殺劑等。

技術領域

本發明涉及一種重組細菌素及其制備方法和應用，特別涉及一種重組細菌素LacAB及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。

背景技術

細菌素的定義最早是在1953年由Jocob提出(Jack RW，Tagg JR，RayB.Bacteriocins of gram-positive bacteria.Microbiol Rev，1995，59：171-200.)，目前，文獻和研究團體采納的細菌素定義是：細菌在代謝過程中通過核糖體產生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質或蛋白類復合物，對親源關系較近的細菌有抑制作用，可以殺滅或抑制與之相似生境的微生物，產生細菌素的菌株具有自身特異免疫性不會殺害產生菌(DattaV，Myskowski SM，Kwinn LA，Chiem DN，Varki N，Kansal RG，Kotb M，Nizet V.Mutationalanalysis of the group A streptococcal operon enc oding streptolysin S and itsvirulence role in invasive infection.Mol Microbiol，2005，56：681-695；Bowdish，D.M.，Davidson，D.J.Hancock，R.E.A re-evaluation of the role of host defencepeptides in mammalian immunity.Curr.Protein Pept.Sci.，2005，6：35～51；DeeganL.H.，Cotter P.D.，Hill C.，et al.Bacteriocins：Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension.International Dairy Journal.4th NIZODairy Conference-Prospects for Health，Well-being and Safety，2006，16：1058-1071.)。細菌素具有多樣性，目前研究較廣泛的是ClassII a和ClassII b(Cotter，P.D.，Hill，C.，Ross，R.P..Bacteriocins：Developing innate immunity for food.NatureReviews Microbiology，2005，3：777-788.)，其中ClassII b細菌素是由兩個不同的肽組成的細菌素，最佳的抑菌活性是兩個肽同時存在的情況下。這兩個肽預先合成一個N-端包含15-30個氨基酸前導序列的雙甘氨酸模型，并被C-端兩個甘氨酸裂開，通過特定ABC-轉運蛋白使細菌素跨膜轉運(Ha^οvarstein LS，Diep DB，Nes IF.A family of bacteriocin ABCtransporters carry out proteolytic processing of their substrates concomitantwith export.Mol Microbiol 1995，16：229-240.)。前導序列促進特定的ABC-轉運蛋白，也有保持細菌素活性的功能直到細菌素分泌。編碼兩個肽預先形成的基因和編碼免疫蛋白的基因在相同操縱子，免疫蛋白保護產生細菌素的菌株不被自身細菌素殺死(Nissen-MeyerJ，Rogne P，Oppega^οrd C，Haugen HS，Kristiansen PE.Structure-functionrelationships of non-lanthionine containing peptide(class II)bacteriocinsproduced by grampositive bacteria.Curr Pharm Biotechnol.2009，10：19-37；Oppega^οrd C，Rogne P，Emanuelsen L，Kristiansen PE，Fimland G，Nissen-Meyer J.The two-peptide class II bacteriocins：structure，production，and mode of action.J MolMicrobiol Biotechnol.2007，13：210-219.)。對于一些細菌素，操縱子也包括編碼特定的ABC-轉運蛋白基因并稱作輔助蛋白。編碼ClassII b細菌素基因至少需要有4個不同基因：編碼前導序列基因，特定的免疫基因，編碼ABC-轉運蛋白的基因，細菌素表觀形成的附屬蛋白基因(Klaenhammer，T.R.Genetics of bacteriocins produced by lactic acidbacteria.FEMS Microbiol Rev.1993，12，39-85.)。