[發明專利]一種重組細菌素及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510367534.2
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104962566B
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 于微;張明輝;高學軍;王琦
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/245
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種重組細菌素LacAB基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一種重組表達載體pGEX-4T-1-LacAB，其特征在于，它包含權利要求1所述的核苷酸序列。

3.構建權利要求2所述重組表達載體pGEX-4T-1-LacAB的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以干酪乳桿菌基因組DNA為模板，設計特異性引物擴增得到ClassIIb細菌素基因的兩段片段，分別為ClassIIb-LacA片段和ClassIIb-LacB片段；

(2)根據步驟(1)獲得的細菌素基因ClassIIb-LacA序列和ClassIIb-LacB序列，設計帶有酶切位點的特異引物采用重疊PCR方法擴增LacAB重組基因序列，擴增得到的LacAB基因產物與同樣酶切的pMD18-T載體連接；

(3)連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞E.coli TOP10，菌落PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆經酶切驗證和測序，得到pMD18-T-LacAB重組克隆載體；

(4)將pMD18-T-LacAB重組克隆載體與表達載體pGEX-4T-1用EcoRⅠ和SalⅠ限制性內切酶雙酶切，pMD18-T-LacAB重組克隆載體的酶切產物LacAB克隆到pGEX-4T-1載體上，構建重組表達載體pGEX-4T-1-LacAB，重組表達載體轉化大腸桿菌感受態細胞E.coli TOP10，菌落PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆經酶切驗證和測序，得到pGEX-4T-1-LacAB重組表達載體。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)中擴增LacA片段的特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；擴增LacB片段的特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述酶切產物LacAB與pGEX-4T-1載體按照摩爾比3:1進行混合，16℃金屬浴過夜連接。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中擴增LacA片段的特異性引物P1/P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；擴增LacB片段的特異性引物P3/P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，且LacA下游引物P2的3’端與LacB的上游引物P3的5’端有15個堿基互補配對；所述重疊PCR方法的具體步驟：第一步，分別以P1/P2、P3/P4為引物，ClassIIb-LacA基因和ClassIIb-LacB基因為模板，進行PCR擴增獲得彼此互補配對的粘性末端的LacA和LacB；第二步，以P1/P4為引物，LacA/LacB模板，進行PCR擴增，獲得重組細菌素基因LacAB。

6.含有權利要求2所述的重組表達載體pGEX-4T-1-LacAB的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌TOP10，DH5α和BL21。

7.一種制備重組細菌素LacAB的方法，其特征在于，將權利要求6所述大腸桿菌BL21經IPTG誘導目的蛋白表達，收集菌液，提取菌液中的重組蛋白，得到的重組蛋白溶液通過GST純化柱，GST標簽和柱子上的GST親和蛋白結合，通過洗脫液得到純化的GST-LacAB蛋白，用凝血酶切除GST標簽后，用GST純化試劑盒純化，得到單一的重組細菌素LacAB。