[發明專利]cry1Ia基因及應用、由其編碼的Cry1Ia蛋白及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201510367317.3
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104946668A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 成飛雪;劉勇;張德詠;宋志強
• 申請（專利權）人: 湖南省植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C07K14/325;C12N15/70;A01N47/44;A01P5/00
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;黃藝平

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，尤其涉及cry1Ia基因及其應用，由cry1Ia基因的編碼的Cry1Ia蛋白和編碼蛋白在寄生線蟲防治上的應用。

背景技術

植物寄生線蟲病是農作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生線蟲所造成的作物損失超過千億美元(Chiwold，2003)，線蟲病害已成為農業生產上的一個突出問題。目前，農業生產上常采用化學殺線蟲劑來防治植物寄生線蟲病害，但現今市場上殺線蟲劑的品種有限，大部分為高毒、高殘留農藥，長期單一地使用高毒、高殘留的化學殺線蟲劑，不僅對環境造成了嚴重的污染，也引發了農產品中農藥殘留超標、線蟲抗藥性日益突出等系列環境和社會問題。近年來，隨著人們對農產品安全的日益關注，化學農藥的使用越來越受到限制，因此，研發有效的殺線蟲微生物以補充或替代化學殺線蟲劑就顯得日益迫切。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上應用最廣泛、最成功的微生物殺蟲劑，被廣泛應用于農業、林業、貯藏以及衛生等領域的害蟲防治。自從1961年Ciordia等首次發現Bt對牛腸道蛇形毛圓線蟲(thichostrongylus?colubriformis)卵和幼蟲有殺滅作用以來，Bt的殺線蟲作用才逐漸引起人們的關注。國內外已報道的具有殺線蟲活性的Bt菌株主要包括Bt蘇云金亞種(B.t.subsp.thuringiensis)、以色列亞種(B.t.subsp.Israelensis)、庫斯塔克亞種(B.t.subsp.Kurstaki)和莫里斯亞種(B.t.subsp.Morris)。這些菌株對多種植物線蟲具有生物活性，如酸醬線蟲(Panagrellus?redivivus)、南方根結線蟲(Meloidogyne?incognita)、穿刺短體線蟲(Pratylenchus?penetrans)和大豆孢囊線蟲(Heterodera?glycines)等(Schnepf，1998)。

1985年Bone等首次證實了Bt伴胞晶體蛋白(δ-內毒素)對線蟲的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因產生的伴胞晶體蛋白對幾種自由生活線蟲的毒性，從兩個主要的B.t.晶體蛋白亞家族中表達出了7種不同的晶體毒素蛋白，通過測試這些晶體毒素蛋白對自由生活的線蟲毒性，證實了其中4種晶體毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)對多種線蟲種類均有活性，所測試的線蟲至少對一種晶體毒素蛋白敏感，從而明確提出Bt晶體毒素蛋白具有殺線蟲能力(Wei?JZ,2003)。B.t.晶體毒素蛋白是由毒素蛋白基因(cry基因)編碼的，不同蘇云金芽胞桿菌亞種或菌株所具有的cry基因不同。1988年以來，美國Mycogen公司分離到一些對秀麗新小桿線蟲、短體線蟲、捻轉血矛線蟲等有毒性的蘇云金芽胞桿菌，并從這些菌株中克隆了一些殺線蟲毒素蛋白基因(參見http://appft.uspto.gov/netacgi)。到目前為止，全世界從B.t.菌株中已分離到的殺線蟲基因主要有cry1、cry5、cry6、cry12、cry13、cry14以及cry21幾大類，但數量十分有限，而且這些菌株、伴胞晶體蛋白及伴胞晶體蛋白基因幾乎都以專利的形式加以保護，所涉及的菌株也多使用代號。因此，分離鑒定新的殺線蟲Bt菌株與伴胞晶體蛋白引起國內外科學家的廣泛重視。

cry1Ia基因是cry基因家族中非常特殊的cry1類基因，最先由Tailor等從B.thuringiensis菌株4835中克隆，該基因編碼一個81KD的蛋白，對鱗翅目的夜蛾科(Noctuidae)、卷葉蛾科(Tortricidae)、菜蛾科(Plutellidae)和鞘翅目的葉甲科(Chrysomelidae)的害蟲具有較好的殺滅效果。cry1Ia基因在大都數Bt菌株中被沉默而沒有表達產物((Kostichka?et?a1,1996)，其主要原因在cry1I基因編碼區上游一般與cryl類基因相鄰，稱為cryl-crylI連鎖，造成了crylI基因自身啟動子的缺乏。

盡管cry1Ia基因在Bt菌株中普遍被沉默，但已有多個基因被克隆，全球分離克隆的cry1Ia基因有13種。但是目前為止，克隆獲得的cry1Ia基因及表達蛋白的殺蟲作用僅限于鱗翅目和鞘翅目害蟲，還沒有cry1Ia基因及表達產物對植物寄生線蟲具有作用活性的相關研究報道。