[發明專利]IFITM3蛋白裝載的外泌體在制備抗登革病毒干擾素拮抗株感染藥物中的應用

在審

• 申請號: 201510365001.0
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN105012935A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發明（設計）人: 黎孟楓;朱勛;何振健;吳玨珩;袁潔;文維韜;胡憶文;陳嘉慧;于暕辰;安樹;董信懷;潘靜;周睿;王小群
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61K35/36;A61K48/00;A61P31/14;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及蛋白質工程技術領域，更具體地，涉及IFITM3蛋白裝載的外泌體在制備抗登革病毒干擾素拮抗株（DENV-2?NGC）感染藥物中的應用。

背景技術

登革病毒（dengue?virus,?DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個病毒種，根據抗原表位的不同分為1，2，3，4四種血清型（DENV1~4）。登革病毒主要通過埃及伊蚊（Aedes?aegypti）和白紋伊蚊（Aedes?albopictus）等昆蟲媒介傳播，引起登革熱（dengue?fever,?DF），以及病死率較高的登革出血熱（dengue?hemorrhagic?fever,?DHF）和登革休克綜合征（dengue?shock?syndrome,?DSS）。目前，登革熱被列為全球最重要的蚊蟲傳播性疾病，已成為一個嚴重的全球性公共衛生問題。盡管如此，目前國內外尚無有效的預防性疫苗，也無針對病毒的特效性治療藥物。

干擾素（interferon,?IFN），是由英國科學家Isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現象時首先發現的。IFN是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復制，同時還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。是目前最主要的抗病毒感染的生物制品。2008年，研究人員發現一株2型登革病毒株DENV2?New?Guinea?C?(NGC)?(GenBank?accession?number?M29095)可以抑制宿主細胞的干擾素免疫應答，并最終確定這種抑制效應是毒株特異性而非血清型特異性。該株登革病毒拮抗干擾素的機制目前正研究中：（1）其中很重要的一個方面是，登革病毒具有拮抗IFN-I產生的能力。據報道，登革病毒NS2B/3蛋白酶通過靶向人細胞的MITA/STING蛋白，干擾RIG-I和MDA5的信號傳遞，抑制宿主細胞IFN-I的產生。（2）另外研究發現，登革病毒NS5與STAT2相結合，NS5蛋白通過蛋白酶體介導STAT2的降解而抑制IFN-I下游信號途徑。目前國內外尚未有針對干擾素拮抗病毒株感染的特異性有效治療藥物。

1984年，Friedman等人在經IFN處理的神經細胞瘤細胞進行cDNA篩查時首次發現干擾素誘導跨膜蛋白家族（interferon-inducible?transmembrane?proteins,?IFITM），位于11號染色體上。人類該基因具有ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5四種類型，表達的蛋白為14-17?kD的跨膜蛋白。2009年Brass等]研究者基于大規模RNA干擾技術的基因組功能篩查，發現IFITM家族蛋白作為一種干擾素誘導的抗病毒蛋白，能較強的抑制流感病毒和黃病毒的對宿主細胞穿入過程，進而發揮高效的抗流感病毒活性。接著，相繼揭示了IFITM蛋白具有廣譜的抗病毒活性。但是，IFITM蛋白在宿主細胞中參與抑制病毒穿入的具體分子機制，以及該蛋白參與宿主的抗病毒天然免疫的作用方式尚未明確還有待深入研究。

外泌體（exosome）又稱胞外體，是由細胞內的多泡體（multivesicularbody,?MVB）與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的一種膜性囊泡，大小為40～100?nm大小。目前研究發現在病毒感染時，宿主細胞會將干擾素誘導的抗病毒蛋白包裝成外泌體形式，進行抗病毒蛋白的細胞間傳遞，使宿主形成更強的抗病毒免疫狀態。2013年，袁正宏教授的研究團隊發現包裝了抗病毒分子的外泌體可直接在肝細胞間傳遞，進而增強了IFN-α誘導的抗病毒免疫應答。外泌體傳遞宿主細胞抗病毒蛋白，為新型抗病毒藥物的開發開拓了新的方向。本研究通過探索包裝抗病毒蛋白的外泌體，是否可以特異性地作用于干擾素拮抗的登革病毒株（DENV-2?NGC），如此可對未來的病毒性病原體所致的疾病的防治提供新的線索與思路。

發明內容

本發明人通過研究發現，通過本發明提供的IFITM3蛋白裝載的外泌體能夠特異性抗登革病毒干擾素拮抗株（DENV-2?NGC），其作用機制為高表達IFITM3蛋白的外泌體能夠特異性地抑制登革病毒干擾素拮抗株（DENV-2?NGC）穿過宿主細胞膜進入宿主細胞的過程。這就為新型抗干擾素拮抗株病毒藥物的開發和機體天然免疫機制的研究開拓了新的方向。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

1.?構建高表達IFITM3重組質粒，制備方法為：