[發明專利]絲狀真菌基因組的提取方法

在審

• 申請號: 201510364596.8
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN104946628A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 張春曉;韓梁彥;王麗麗
• 申請（專利權）人: 河北科技大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/82;C12R1/685;C12R1/885;C12R1/80
• 代理公司: 石家莊旭昌知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 13126
• 代理人: 彭隨麗

技術領域

本發明涉及一種絲狀真菌基因組提取方法，尤其涉及一種產黃青霉菌基因組的提取方法。

背景技術

????工業微生物中，絲狀真菌是一類十分重要的類群，尤其在抗生素、有機酸、酶制劑三大生產領域，絲狀真菌的生產性能極為突出，如產黃青霉(Penicillium?chrysogenum)是青霉素的重要生產絲狀真菌；黑曲霉?（Aspergillus?niger）是檸檬酸的重要工業發酵菌種;?里氏木霉(Trichoderma?reesei?)?是纖維素酶的重要工業發酵菌種。為進一步提高青霉素、檸檬酸及纖維素酶的產量，從分子水平上對工業菌株進行改造有著廣泛的應用前景。絲狀真菌基因組DNA的提取是進行分子生物學研究的基礎，但絲狀真菌由于其細胞壁結構堅固，成分復雜，破壁困難，因此絲狀真菌基因組提取方法與細菌相比要復雜得多。現行有效的絲狀真菌基因組提取方法主要有：酶解法，研磨法、凍融法和微波法、CTAB法、SDS法、試劑盒法、尿素提取法等。這些方法都可以提出較高質量的基因組DNA，能夠滿足后續的如PCR反應的基因操作需求，但對于成千上萬個絲狀真菌轉化子的分子鑒定及篩選，應用這些常規方法提取基因組，其繁雜的提取過程是限制實驗進展的一個重要環節；另外，常規的提取方法中均采用多種試劑對細胞進行破壁處理、酚/氯仿抽提去除蛋白質、乙醇或異丙醇沉淀等多步驟提取DNA，提取過程冗長，且有機試劑具腐蝕性和毒性，對操作者身體健康不利。

發明內容

為解決現有技術中存在的不足，本發明提供了一種簡易、安全，不需使用有毒試劑的絲狀真菌基因組的提取方法。

為實現上述目的，本發明的一種絲狀真菌基因組的提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

a、獲取絲狀真菌菌絲；

b、加入酶液：向絲狀真菌菌絲加入蝸牛酶和纖維素酶的混合酶液，得到絲狀真菌菌絲液；

c、超聲處理：將步驟b獲得的絲狀真菌菌絲液于40~70W超聲5~15min；

d、酶解：將步驟c處理后的絲狀真菌菌絲液在25~40℃酶解10~15h，得到絲狀真菌菌絲酶解液；

e、將絲狀真菌菌絲酶解液靜置，待絲狀真菌菌絲酶解液分層后，獲得供PCR鑒定用含有絲狀真菌基因組的上清液；

在步驟a與步驟b之間或步驟d與步驟e之間，設有對絲狀真菌菌絲或絲狀真菌菌絲酶解液進行高溫加熱處理步驟，所述高溫加熱處理步驟中的加熱溫度為75~100℃，加熱時間為5~15min。

對絲狀真菌細胞僅進行酶解破壁處理，會因破壁后存在的大量雜質影響，造成DNA不穩定，使后續PCR過程擴增得不到基因條帶。本發明采取酶解法,?結合超聲處理與高溫加熱處理的方式：向絲狀真菌菌絲加入蝸牛酶和纖維素酶的混合酶液，然后通過超聲處理將絲狀真菌菌絲分散到混合酶液中，破壞菌絲的致密狀態，使大部分菌絲能夠接觸到混合酶液而被酶解，同時，超聲作用有助于后續酶解反應的進行；之后通過高溫處理對細胞裂解后釋放的DNase等降解DNA的活性物質及混合酶液中存在的影響PCR反應的活性物質進行滅活，從而使絲狀真菌菌絲酶解液的上清液可以直接進行PCR擴增得到絲狀真菌18S?rDNA基因條帶。制備方法中高溫加熱處理也可在絲狀真菌菌絲液加入混合酶液前進行，同樣能夠對細胞內存在的降解DNA及影響PCR反應的物質起到滅活的作用。本發明的提取方法操作流程簡單，且不需使用試劑對DNA進行提純，避免了毒性試劑對實驗人員的傷害，簡化了提取過程，使提取方法更安全，穩定。

作為對上述方式的限定，所述高溫加熱處理步驟中的加熱溫度為95~98℃，加熱時間為10~15min。

作為對上述方式的限定，所述步驟e中絲狀真菌菌絲酶解液靜置前，用雙蒸水稀釋，混勻。

所獲樣品量大時通過稀釋有利于PCR反應。

作為對上述方式的限定，所述步驟b每0.05~0.1mg絲狀真菌菌絲加入混合酶液1mL，所述混合酶液中蝸牛酶濃度4~8mg/mL，纖維素酶濃度2000~6000U/mL。

酶濃度過低，不足以破壞細胞壁，致使DNA不能有效釋放；酶濃度過高，細胞壁裂解完全，細胞膜受到破壞，致使DNA釋放出來而被酶解液中物質降解，從而使PCR反應結果受到影響。

作為對上述方式的限定，所述混合酶液中蝸牛酶濃度6~8mg/mL，纖維素酶濃度2000~4000U/mL。