[發(fā)明專利]花生過敏源蛋白的特征肽及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510364580.7
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104987363A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任一平;張京順;洪宇偉;陳啟;陳苘
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K7/06;C07K14/415;G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種花生過敏源蛋白的特征肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

花生也是一種常見的過敏源食物，由它引起的過敏反應(yīng)占食物過敏的1％～20％。目前，公認(rèn)的花生致敏蛋白有13種。其中，Ara?h1和Ara?h2是主要花生過敏源，分別約占花生蛋白總量的12～16％和5.9-9.3％，都能被90％以上的花生過敏患者血清所識別。Ara?h1在天然狀態(tài)下主要是以單聚體和三聚體形式存在的水溶性蛋白，包含23個線性IgE結(jié)合位點。Ara?h2存在兩種異構(gòu)體，包含10個線性IgE結(jié)合位點。Ara?h2穩(wěn)定性高、耐酶解，主要原因是Ara?h2含有大量二硫鍵，用以保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Ara?h2具有典型的胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)，并且經(jīng)過烘烤處理后，Ara?h2蛋白的抑制劑活性被顯著提高。

目前，檢測食物中花生過敏源成分主要有2種方法。一種是基于DNA檢測的方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。該方法靈敏度高，特異性強，但是由于不直接檢測致敏蛋白，故無法進(jìn)行定量分析。此外，現(xiàn)代食品工業(yè)可以將蛋白質(zhì)和DNA完全分離開來，所以PCR法有假陰性的風(fēng)險。另外一種基于蛋白的檢測方法，如酶聯(lián)免疫法(ELISA)。此方法也具有高靈敏度、高特異性等特點，但該應(yīng)用方法在熱加工食品中的檢測結(jié)果通常會低于真實值，主要因為熱處理會使蛋白質(zhì)變性，降低蛋白質(zhì)溶解度，同時改變蛋白質(zhì)表面位點，使其不易被抗體正確識別。此外，ELISA法采用抗原抗體技術(shù)不可避免會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象，也會影響最終檢測結(jié)果。

現(xiàn)階段有人嘗試將蛋白質(zhì)組學(xué)與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)運用到對蛋白質(zhì)的定性定量分析中。Heick等(Heick，J.，M.Fischer，and?B.First?screening?methodfor?the?simultaneous?detection?of?seven?allergens?by?liquid?chromatography?mass?spectrometry.Journal?of?Chromatography?A，2011.1218(7)：p.938-943)和Shefcheck等人(Shefcheck，K.J.and?S.M.Musser，Confirmation?of?the?allergenic?peanut?protein，Ara?h1，in?a?model?food?matrix?using?liquid?chromatography/tandem?mass?spectrometry(LC/MS/MS).Journal?of?agricultural?and?food?chemistry，2004.52(10)：p.2785-2790)先后建立應(yīng)用酶解技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測花生過敏蛋白的方法。Lutter?P等(Lutter，P.，V.Parisod，and?H.Weymuth，Development?and?validation?of?a?method?for?the?quantiftcation?of?milk?proteins?in?food?products?based?on?liquid?chromatography?with?mass?spectrometric?detection.Journal?of?AOAC?International，2011.94(4)：p.1043-1059.)在檢測過程中，在預(yù)處理結(jié)束后加入了穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽作為內(nèi)標(biāo)，以校正基質(zhì)效應(yīng)對質(zhì)譜離子化帶來的影響。Zhang等(Zhang，J.，et?al.，Determination?of?bovine?lactoferrin?in?dairy?products?by?ultra-high?performance?liquid?chromatography-tandem?mass?spectrometry?based?on?tryptic?signature?peptides?employing?an?isotope-labeled?winged?peptide?as?internal?standard.Analytica?chimica?acta，2014.829：p.33-39.)和Chen等(Chen，Q.，et?al.，Quantification?of?bovine?β-casein?allergen?in?baked?foodstuffs?based?on?ultra-performance?liquid?chromatography?with?tandem?mass?spectrometry.Food?Additives&Contaminants：Part?A，2015.32(1)：p.25-34)人在穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽的基礎(chǔ)上，根據(jù)蛋白質(zhì)原有序列，向氮端和碳端各延長了6-8個氨基酸。該多肽在酶解之前加入樣品中，可在酶的作用下形成同位素標(biāo)記的特征肽，所以它除了能對離子化過程進(jìn)行校正之外，還能校正基質(zhì)對酶切過程造成的干擾，使建立的方法較之前的方法更加準(zhǔn)確可靠。