[發明專利]花生過敏源蛋白的特征肽及其應用

在審

• 申請號: 201510364580.7
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104987363A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 任一平;張京順;洪宇偉;陳啟;陳苘
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K7/06;C07K14/415;G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

1.一種花生過敏源蛋白的特征肽，其特征在于，氨基酸序列為DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR。

2.一種用于檢測花生過敏源蛋白的內標物，其特征在于，氨基酸序列為IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的氨基酸。

3.一種液質聯用檢測花生過敏源蛋白的試劑盒，包括特征肽和內標物，其特征在于，所述特征肽的氨基酸序列為DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述內標物的氨基酸序列為IEKQAKDL*AFPGSGEQV*EKLIKNQ或QFKRELRNL*PQQCGL*RAPQRCD，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的氨基酸。

4.如權利要求3所述的試劑盒在檢測花生過敏源蛋白中的應用。

5.一種液質聯用檢測花生過敏源蛋白的方法，包括：

(1)配制系列含花生過敏原蛋白的特征肽和同位素標記特征肽的標準溶液，利用液質聯用進行分離檢測，計算特征肽和同位素標記特征肽的峰面積比，線性回歸得到方程Y＝kX+b，其中Y為特征肽和同位素標記特征肽的峰面積比，X為特征肽的濃度；

所述特征肽的氨基酸序列為DLAFPGSGEQVEK或NLPQQCGLR，所述同位素標記特征肽的氨基酸序列為DL*AFPGSGEQV*EK或NL*PQQCGL*R；

(2)取待測樣品，與內標物混合溶于水后進行酶解，在相同條件下對酶解液利用液質聯用進行分離檢測，計算特征肽和同位素標記特征肽的峰面積比，根據所述方程得到酶解液中所述特征肽的濃度，最后計算得到樣品中花生過敏源蛋白的含量。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解的溫度為35～37℃，時間為5～6h。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)和(2)中，所述液質聯用的液相色譜條件為：色譜柱：Acquity?BEH?300C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱溫：40℃；進樣體積：5μL；流動相A：0.1％甲酸/水；流動相B：0.1％甲酸/乙腈；流速0.3mL/min；洗脫程序為：流動相B起始濃度為7％，8min內線性上升為25％，9min下降至7％并保持3分鐘。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)和(2)中，所述液質聯用的質譜分析條件為：電噴霧離子源電離模式：ESI+；毛細管電壓：3.5kV；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：800L/min；錐孔反吹氣流量：150L/h；碰撞室壓力：7.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.77V；高端分辨率1：15.09V；離子能量1：0.1；低端分辨率2：2.80V；高端分辨率2：14.79V；離子能量2：0.6；離子源溫度：150℃；提取器電壓：3.0V；入口透鏡電壓：0.5V；出口電壓：0.5V；碰撞梯度：4.0。

9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，酶解前，添加濃度為500～700mmol/L的二硫蘇糖醇。