[發明專利]量子點陽離子交換信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法

在審

• 申請號: 201510364429.3
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104914084A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 方維煥;章先;李肖梁;王歆;謝琿;時玉菲;孫孟嬌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種基于量子點陽離子交換和信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法。

背景技術

生物毒素又稱為天然毒素，是指來源于生物，包括動物、植物、微生物產生的對其它生物物種有毒害作用并不能自身復制的各種化學物質。人類對生物毒素的最早體驗源于頻發的食物中毒事件，而引起食物中毒的大部分均為生物毒素，并且以微生物毒素最常見。微生物毒素包括蛋白類毒素和真菌毒素，其中蛋白類毒素是相關病原菌致病的主要因素，如金黃色葡萄球菌分泌的A、C型腸毒素、產氣莢膜梭菌腸毒素E或蠟樣芽孢桿菌分泌的腸毒素FM等均可刺激宿主嘔吐中樞，導致出現以嘔吐為主要癥狀的食物中毒。因此建立蛋白類毒素快速準確靈敏的檢測方法，日益成為食品安全領域的重要研究內容，受到社會各界的高度重視。

蛋白類毒素的常規檢測手段主要包括儀器分析法和酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked?immunosorbent?assay,ELISA)，其中儀器分析法因設備昂貴、操作復雜等缺點無法大面積推廣使用。基于抗原抗體反應的ELISA檢測方法操作流程相對簡單，現階段已成為實驗室診斷的常規手段，但其靈敏度和穩定性容易受到眾多因素的干擾，尤其是傳統基于辣根過氧化物酶(HRP)的酶催化顯色法，在定性和定量檢測時常受到酶標試劑、顯色時間、酶催化底物信號穩定性等諸多因素的制約，影響了結果的均一性和準確性。同時酶標法檢測靈敏度有限，無法做到痕量檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種基于量子點陽離子交換和信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種基于量子點陽離子交換和信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法，是利用羧基修飾的水溶性硒化鎘/硫化鋅量子點(CdSe/ZnS，CdSe為核心，ZnS為殼層，表面由疏水配體包裹，最后包覆一層聚合物達到水溶性狀態，經過羧基官能團修飾后，可與特定生物分子進行共價偶聯)對蛋白類毒素多克隆抗體進行標記，使量子點上的羧基與抗體氨基在偶聯劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的作用下形成穩定的量子點標記的蛋白類毒素多克隆抗體；檢測時蛋白類毒素特異性單克隆抗體作為捕獲抗體，量子點標記的多克隆抗體作為檢測抗體，采用夾心ELISA模式，利用陽離子交換技術對信號進行放大，并通過設置陰性對照，計算樣本孔的熒光數值與陰性對照孔熒光數值的比值，若比值≥2.1，則說明該樣本中含有目標蛋白毒素，判定為陽性樣本，檢測過程中可通過設置梯度濃度的蛋白毒素標準品，并根據不同濃度與相其對應的熒光比值繪制標準曲線，實現蛋白類毒素的定性檢測和定量分析。

本發明中，所述的陽離子交換信號放大技術是指：通過陽離子交換方法置換出量子點標記的蛋白類毒素多克隆抗體中的Cd²⁺，利用羅丹明(Rhod-5N)對Cd²⁺極度敏感并產生熒光強度變化的原理對信號進行放大，通過全波長酶標儀(購自美國Molecular?Devices；型號M2)對熒光信號進行檢測。

本發明中，所述的偶聯劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。

本發明中，所述蛋白類毒素是金黃色葡萄球菌A、C型腸毒素、產氣莢膜梭菌腸毒素E或蠟樣芽孢桿菌腸毒素FM中的任意一種。

本發明的原理描述：

本發明利用量子點成分CdSe在Ag²⁺存在的條件下可以和Ag²⁺發生陽離子交換反應，生成更穩定的AgSe納米晶體和Cd²⁺，并利用熒光染料Rhod-5N對Cd²⁺極其敏感的這一特性，設計了基于量子點陽離子交換和信號放大技術的檢測蛋白類毒素的方法，其下限可以達到皮克水平。

本發明采用量子點取代常規的辣根過氧化物酶(HRP)對抗體進行標記，并根據量子點的化學成分特性，利用陽離子交換技術對最終的檢測信號進行放大，使得檢測的靈敏度大大提高，同時避免了常規ELISA檢測過程中，上述因素對結果造成的影響，相比酶催化顯色，本方法的準確性和穩定性大大提高，并且可以對待檢樣本中的蛋白類毒素進行定性和定量分析。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

(1)本發明利用新型熒光材料量子點取代常規的辣根過氧化物酶(HRP)對蛋白類毒素多克隆抗體進行標記，開發了蛋白類毒素快速檢測新技術，在提高檢測靈敏度和穩定性的同時，縮短了檢測的時間，夾心法定量檢測蛋白類毒素時僅需90min。