[發明專利]量子點陽離子交換信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法

在審

• 申請號: 201510364429.3
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104914084A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發明（設計）人: 方維煥;章先;李肖梁;王歆;謝琿;時玉菲;孫孟嬌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.量子點陽離子交換信號放大技術檢測蛋白類毒素的方法，其特征在于，是利用羧基修飾的水溶性硒化鎘/硫化鋅量子點對蛋白類毒素多克隆抗體進行標記，使量子點上的羧基與抗體氨基在偶聯劑的作用下形成穩定的形成量子點-多克隆抗體偶聯物；然后以夾心ELISA模式對蛋白類毒素進行檢測，采用陽離子交換信號放大技術對結果進行分析，實現蛋白類毒素的定性檢測和定量分析。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的陽離子交換信號放大技術是指：通過陽離子交換方法置換出量子點-抗體偶聯物中的Cd²⁺，利用羅丹明對Cd²⁺極度敏感產生熒光強度變化的原理進行信號放大，并通過全波長酶標儀對熒光信號進行檢測。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的偶聯劑是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白類毒素是金黃色葡萄球菌A、C型腸毒素、產氣莢膜梭菌腸毒素E或蠟樣芽孢桿菌腸毒素FM等中的任意一種。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)量子點與蛋白類毒素多克隆抗體的偶聯

取純化后的多克隆抗體，溶解于0.01M、pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中；取50μl濃度為8μM的羧基修飾的量子點置于2ml?EP管中，加入300μg待標記的蛋白類毒素多克隆抗體，使反應總體系為400μl；加入抗體后若體積不足，則用10mM的硼酸鹽緩沖液補齊；持續混勻反應5min后，加入15μl濃度為10mg/ml的偶聯劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；室溫震蕩反應2h后，離心去除反應過程中產生的團聚物，上清液經超濾管濃縮后，用尺寸排阻色譜柱純化；色譜柱填料為Superdex?G200，純化后的量子點標記的多克隆抗體保存于4℃冰箱，備用；

(2)最佳檢測條件的確定

采取夾心ELISA模式進行檢測，即：白色不透明96孔板包被蛋白類毒素特異性單克隆抗體作為捕獲抗體，加入待檢樣本進行作用，洗去非特異性結合后，再加入量子點標記的蛋白類毒素多克隆抗體作為檢測抗體進行作用，洗去非特異性結合后，通過陽離子交換信號放大技術，使用全波長酶標儀在激發波長與發射波長分別為551/575的條件下對信號進行檢測；

確定夾心ELISA最佳檢測條件，包括對單克隆抗體的最佳包被濃度與量子點標記多克隆抗體的最佳使用濃度的確定；具體方法是：以pH＝9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋單克隆抗體并包被于白色不透明96孔板，洗滌封閉后，加入梯度稀釋的待檢蛋白類毒素標準品，同時設置陰性對照孔即加入標準品稀釋液，37℃恒溫培養箱作用45min洗滌后加入稀釋的量子點標記的多克隆抗體，37℃恒溫培養箱作用45min，洗滌后置于吸水紙上扣干，加入200μl顯色液室溫放置5min后，酶標儀在激發波長與發射波長分別為551/575的條件下讀取熒光數值；所述顯色液是以pH＝7.4的0.01M醋酸鹽緩沖液配置，含5μM/LRod-5N和300μM/L?Ag²⁺；

分別計算在不同蛋白類毒素單克隆抗體包被濃度與不同量子點標記蛋白類毒素多克隆抗體作用濃度條件下的檢測效果，蛋白類毒素多克隆抗體作用濃度以量子點濃度計算；選取熒光比值≥2.1時能檢測到最低蛋白類毒素濃度所對應的單克隆抗體包被濃度與量子點標記多克隆抗體作用濃度作為檢測時的最佳條件；

(3)標準曲線的繪制與實際樣本的檢測

將特異性單克隆抗體用PH＝9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋到最佳包被濃度之后，加入到96孔板中，100μl/孔，4℃放置過夜；洗滌封閉后，取均為100μl待檢樣品和梯度稀釋的蛋白類毒素標準品加入孔中，并設置陰性對照孔即加入標準品稀釋液；37℃培養箱作用45min后，洗滌后再加入稀釋到作用濃度的量子點標記的蛋白類毒素多克隆抗體，100μl/孔；37℃培養箱避光作用45min，洗滌并于吸水紙上扣干，加入200μl顯色液；顯色液以0.01M?pH＝7.4的醋酸鹽緩沖液配置，分別含有5μM/L?Rod-5N和300μM/L?Ag²⁺；室溫放置5min顯色后，以全波長酶標儀在激發波長與發射波長分別為551/575的條件下讀取熒光數值；將得到的梯度稀釋的標準品對應的熒光比值擬合成標準曲線，然后對待檢樣品中是否含有目標蛋白類毒素進行定性判定：熒光比值≥2.1判定為陽性；熒光比值<2.1判定為陰性；若為陽性，則根據繪制的標準曲線對樣本中蛋白類毒素含量進行定量分析。