[發(fā)明專利]檢測金黃色葡萄球菌及mecA的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510363950.5
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104894284A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設計）人: 蔡先全;柏建山;單振菊;邱德義;蕭綺倩;李蓉;邱霞;周思渝
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測檢測金黃色葡萄球菌及耐藥基因mecA的引物；本發(fā)明還涉及一種包括上述引物的用于檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因mecA的雙重熒光PCR檢測試劑盒，本發(fā)明還涉及一種采用上述試劑盒檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因mecA的方法。

背景技術

葡萄球菌是革蘭氏陽性球菌中的一種，廣泛分布于自然界，如空氣、水、飼料和一些食品中，也存在于人和動物的體表、鼻咽部及腸道。致病性葡萄球菌常引起各種化膿性疾患、敗血癥或膿毒敗血癥，當污染食品時，可引起食物中毒。1974年葡萄球菌屬分為三種:金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌腳。其中金黃色葡萄球菌staphylococcus.aureus致病力最強，也最重要。金黃色葡萄球菌除了常引起皮膚、組織及器官的化膿性炎癥外，其產(chǎn)生的腸毒素可沾染食物而致食物中毒。

由于抗生素的使用，細菌也為了自身發(fā)展而不斷變異，就形成了細菌對抗菌藥物的耐藥性，使本來有效的抗菌藥物在遇到耐藥菌引起的感染時療效下降甚至完全無效。金黃色葡萄球菌至今仍然是國內(nèi)外醫(yī)院獲得性感染最常見的細菌之一。隨著β-內(nèi)酞胺類抗生素在臨床的廣泛應用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA在臨床分離的葡萄球菌中比例不斷增加，MRSA幾乎對所有β-內(nèi)酞胺類抗生素都耐藥。1996年，又出現(xiàn)了首例對萬古霉素敏感性下降的MRSA。一旦對萬古霉素耐藥，臨床可選用藥物將非常有限，從而造成治療上的困難。研究可靠的檢測方法，對其準確、及時的檢出，對于控制耐藥菌的播散極為重要。

本發(fā)明選擇的目的基因為谷氨酸鐵還原合成酶glutamate?synthase-ferredoxin?large?subunit,gltB，序列同源性相對保守，能夠較好的將金黃色葡萄球菌和其他食源性致病菌進行區(qū)分。也是1870-2007《食品中致病菌檢測方法實時PCR法》中檢測金黃色葡萄球菌的靶基因。

本發(fā)明選擇的另外一個目的基因為mecA基因，該基因負責編碼青霉素結合蛋白2a(PBP2a)，它降低β-內(nèi)酰胺抗生素親和力，而PBP2a與固有的PBP2共同作用，使得細菌盡管在β-內(nèi)酰胺抗生素的環(huán)境中也能合成細胞壁，使細菌對青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素耐藥。mecA基因位于葡萄球菌染色體mec盒staphylococcal?cassette?chromosome?mec簡稱SCC?mec側(cè)面DNA的特有片段上。SCC?mec是一個攜帶mec基因復合體的可移動基因島genomic?islands，GI，甲氧西林耐藥和其他抗生素耐藥基因在此不斷積累，形成耐藥島resistance?island，RI，導致MRSA對抗生素雙重耐藥。

傳統(tǒng)細菌耐藥性方法雖然能夠滿足臨床的部分需要，但這些方法仍然存在一些缺點，例如檢測時間較長和檢測結果不夠準確等。因此，隨著分子生物學技術在臨床檢驗領域的應用近年來發(fā)展了一系列快速細菌鑒定或分子檢測技術，這類方法的特點是快速而準確，一般在幾個小時之內(nèi)就可以得到檢測結果，大大縮短了檢測時間。針對金黃色葡萄球菌和mecA相關基因，研究人員已開展了常規(guī)PCR和熒光PCR方法研究，但常規(guī)PCR方法需要PCR擴增后進行電泳，不僅操作繁瑣，而且容易引起污染，還需要使用可能致癌的熒光燃料，而探針法熒光PCR方法雖然靈敏準確，但是其檢測成本較高，而且試劑有效期短，很容易降解。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種用于檢測金黃色葡萄球菌及mecA用的引物；

本發(fā)明的另一個目的是提供一種包括上述引物且組分和配比合理，使用方便，檢測快捷，準確，適用于雙重熒光PCR檢測金黃色葡萄球菌及耐甲氧新林耐藥基因mecA的試劑盒；

本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測金黃色葡萄球菌及mecA基因的方法，該方法操作簡便、快速，成本低，檢測結果準確。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

一種檢測金黃色葡萄球菌及mecA用的引物，其特征在于該引物的序列分別為：

上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC

上游引物mecAF：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

下游引物mecAR：TTTATCGGACGTTCAGTC。

一種檢測金黃色葡萄球菌及mecA用的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20μL反應體系包括以下組分：