[發明專利]檢測金黃色葡萄球菌及mecA的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201510363950.5
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104894284A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 蔡先全;柏建山;單振菊;邱德義;蕭綺倩;李蓉;邱霞;周思渝
• 申請（專利權）人: 蔡先全
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種檢測金黃色葡萄球菌及耐藥基因mecA用的引物，其特征在于該引物的序列分別為：

上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC

上游引物mecAF：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

下游引物mecAR：TTTATCGGACGTTCAGTC。

2.一種檢測金黃色葡萄球菌及耐藥基因mecA用的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20μL反應體系包括以下組分：

其中所述上游引物gltBF的序列：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

所述下游引物gltBR的序列：GGATAATGAAGGGAAACC

所述上游引物mecAF的序列：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

所述下游引物mecAR的序列：TTTATCGGACGTTCAGTC。

3.根據權利要求2所述的一種檢測金黃色葡萄球菌及mecA用的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20μL反應體系包括以下組分：

4.一種檢測金黃色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA；

B、利用如權利要求2或3所述的試劑盒對步驟A中的樣品DNA進行PCR擴增；

C、擴增后對產物進行高分辨率熔解曲線分析，并結合擴增曲線判定結果。

5.根據權利要求4所述檢測金黃色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步驟B中PCR擴增的反應程序按以下步驟進行：

(1)92℃～96℃預變性30s；

(2)92℃～95℃變性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共進行35～45個循環；

(3)72℃延伸10s～30s。

6.根據權利要求5所述檢測金黃色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步驟C中所述高分辨率熔解曲線分析，按以下步驟進行：

(1)92℃～96℃變性1min；

(2)40℃復性1min；

(3)然后初始熔解溫度60℃～65℃，開始程序升溫熔解至90℃～95℃，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，15～25次/秒。

7.根據權利要求6所述檢測金黃色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品DNA的具體步驟如下：

取1.5mL培養物10000rpm離心2min；沉淀物加入500μL的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，8000r/min離心3min，去盡上清，向沉淀中加入200μl的50mg/mL的溶菌酶溶液、30μL?10％SDS和15μL的蛋白酶K，渦旋混勻后，于37℃溫育1h；加入100μL的5mol/L?NaCl，充分混勻，再加入80ul?CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min，將上清轉入一只新管中，加入0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來；沉淀用1mL的70％乙醇洗滌后，加入TE溶液溶解沉淀。