[發明專利]LAMP技術鑒別魚翅真偽用的引物及方法

有效

• 申請號: 201510363949.2
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN104946766B
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 陳定虎;陳祖華;王振華;劉恭源;熊仁廣;周敏;劉曉媚;張靜;馮雪雅;管維;吳穎兒
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種用LAMP技術鑒別魚翅真偽的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、魚翅DNA的提取采用納米磁珠提取魚翅DNA；

B、建立LAMP反應體系25μL的LAMP反應體系包括20μL預反應溶液和5μL DNA模板，其中20μL預反應溶液，由以下組分組成:

2X反應緩沖液12.5μL，引物2-4μL，熒光目視檢測試劑1.0μL，酶溶液1.0μL，去離子水補齊至20μL；

所述引物的序列包括：

正向外引物F3：5'-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；

反向外引物B3：5'-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；

正向內引物FIP：

5'-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；

其中所述正向內引物FIP包含F1c和F2序列：

F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；

F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA

反向內引物BIP：

5'-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’

所述反向內引物BIP包括含B1c和B2序列：

B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；

B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA；

C、向Loopamp反應試管中分別加入上述預反應溶液各20μL；

D、在預反應溶液中加入待檢測的待檢測樣品DNA 5μL，使總量達到25μL；

E、對照反應中，陰性對照反應使用普通鯉魚DNA 5μL，空白對照反應使用去離子水5μL，陽性對照使用魚翅本身提取的DNA 5μL；

F、用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心；

G、將混合物置于LAMP濁度儀的反應孔中，于60-70℃恒溫反應90min，最后60-80℃下保溫5min以結束反應；

H、采用LAMP濁度儀方法或熒光目測的方法檢測檢驗結果,

所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向內引物FIP+反向內引物BIP)的濃度比為1:2-1:10。

2.根據權利要求1所述的一種用LAMP技術鑒別魚翅真偽的方法，其特征在于所述的FIP和BIP各1.6μM，各40pmol；F3和B3各0.2μM，各5pmol。

3.根據權利要求1所述的一種用LAMP技術鑒別魚翅真偽的方法，其特征在于步驟A中所述的納米磁珠提取魚翅DNA具體步驟：

1)制樣：將不同魚翅樣品用銼刀磨碎，取磨碎樣品0.1-0.5g的魚翅組織加入1mL抽提緩沖液進行研磨制成樣品；

2)清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反復清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH₂O；

3)結合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；

4)清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；

5)裂解：加入50μL ddH₂O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；

6)取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為魚翅DNA。

4.根據權利要求1所述的一種用LAMP技術鑒別魚翅真偽的方法，其特征在于所述的LAMP濁度儀方法包括有實時濁度檢測和/或終點度檢測。

5.根據權利要求1所述的一種用LAMP技術鑒別魚翅真偽的方法，其特征在于所述熒光目測的方法：

使用紫外線照射裝置從試管底部向上進行照射，佩戴紫外防護眼鏡從試管側面進行觀查；如果與陽性對照一樣發出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對照一樣沒有發出熒光，而判定為陰性。