[發明專利]一種溶解池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業化多級聯通液體發酵方法

在審

• 申請號: 201510363030.3
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN105039209A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 文國樑;曹煜成;李卓佳;胡曉娟;徐煜;徐創文
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/085
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

技術領域

本發明屬于微生物制劑技術領域，具體涉及一種溶解池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業化多級聯通液體發酵方法。

背景技術

隨著水產養殖業迅猛發展，養殖過程產生的大量殘餌、代謝產物造成池塘水體富營養化日益加劇，導致藍藻大量繁殖，藍藻水華高頻率爆發(彭聰聰等，2011)。藍藻會大量耗氧且能釋放藍藻毒素、羥胺及硫化氫等有毒有害物質，嚴重敗壞養殖水體，造成養殖對象的中毒死亡，對水體生態環境和養殖效益造成巨大影響(劉孝竹等，2009)。有研究表明，利用溶藻菌可特異性地抑制有害微藻，達到優化水體微藻群落的效果(趙以軍，1996；裴海燕等，2005；王祥榮等，2010)。當前該領域的研究熱點還主要為針對海洋赤潮和湖沼水華的有害微藻種類的特性與治理等方面，YANG等篩選了溶解赤潮中肋骨條藻(Skeletonemaostatum)的溶藻菌SK-5(YANGetal,2013)，THEERASAK等篩選了殺滅引起藍藻水華的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的放線菌(THEERASAKetal,2013)，但有關運用溶藻菌抑制池塘水體有害微藻的研究少見報道(TEEYAPORNetal,2012；賈雯等，2013)。池塘環境與上述水體環境差異巨大，在微藻優勢種群結構、水體營養水平、人工技術措施等方面的差別致使針對開放性水域的相關研究無法直接借鑒到養殖生產應用中。對此，曹煜成等篩得了一株池塘藍藻溶藻菌—蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)CZBC1，該菌株對養殖池塘中的顫藻、微囊藻等有害藍藻具有良好的溶藻專一性(曹煜成等，ZL201310203745.3)。另有報道，蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于環境中，它屬于革蘭氏陽性菌，其非毒性菌株可用以調節生物消化道菌群，凈化養殖水質，促進養殖生物健康生長，目前已被應用于醫藥、農業生產等領域(李煜等，2012；李俠等，2001)。陽鋼等通過向水體潑灑蠟樣芽孢桿菌BC-1有效提高了刺參的生長速度(陽鋼等，2012)，何鑒堯等篩得兩株蠟樣芽孢桿菌L7和L8對螺旋鞘絲藻均有顯著地控制效果(何鑒堯等，2008)。

近年來，報道的溶藻細菌主要有：黃桿菌屬、節桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、噬胞菌屬、交替假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、腐生螺旋體屬、屈撓細菌屬、纖維弧菌屬及蛭弧菌屬等。曹煜成等篩得的蠟樣芽孢桿菌CZBC1經實驗室生態學試驗證實，其具有適應廣溫、廣鹽、耐高pH和低耗氧的特性，可以通過直接或間接機制溶解浮游顫藻、綠色顫藻、小顫藻等有害藍藻，具有良好的顫藻溶解專一性，對其他優良綠藻和硅藻等無溶解效應，并且對養殖對蝦也無不良影響，適宜池塘水產養殖生產應用(曹煜成，2014)。

目前針對蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌劑的工業化液體發酵生產方法還未見報道。雖然有學者就蠟樣芽孢桿菌發酵工藝、溶藻菌發酵條件優化等進行過報道(王海云等，一株蠟樣芽胞桿菌及其制備方法應用，申請號201410223612.7；朱杰等，芽孢桿菌屬溶藻菌的固體發酵與應用，申請號201210308126.6；孫梅等，一種巨大芽孢桿菌及其固體發酵制備菌劑的方法和應用，申請號201310413693.2；榮小軍等，一種蠟樣芽孢桿菌及其制劑和應用，申請號201010602326.3；葉姜瑜等，響應曲面法優化溶藻細菌發酵條件的研究，2011；許珂等，溶藻細菌W5培養條件優化及發酵培養)。由于蠟樣芽孢桿菌不是所有菌株都具備溶藻特性，而上述研究中的溶藻菌亦并非本專利所涉及的蠟樣芽孢桿菌或類似的溶藻菌株，加之有關溶藻菌發酵研究的報道仍多為研究性質，遠未達到菌劑的工業化發酵生產的需求，也未見相關菌劑的工業化生產產品。

發明內容

本發明的目的是提供一種溶解池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業化多級聯通液體發酵方法，該方法確定了發酵工藝參數，一方面保證該方法可滿足蠟樣芽孢桿菌制劑產品的工業化液體發酵生產需求，另一方面保證形成的蠟樣芽孢桿菌制劑產品并未因工業化和規模化的生產致使其溶藻特性丟失或發生改變，仍具有良好的顫藻溶解專一性，對優良綠藻和硅藻無溶解效應，對養殖對蝦也無不良影響，可用于養殖生產應用。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種溶解池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業化多級聯通液體發酵方法，包括以下步驟：

(1)確定蠟樣芽孢桿菌CZBC1的多級聯通發酵罐培養的發酵培養基；

(2)活化培養：將保種的蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌種進行活化培養，得活化的蠟樣芽孢桿菌CZBC1；