[發(fā)明專利]一種溶解養(yǎng)殖池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業(yè)化液體—固體復(fù)合發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510362557.4
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN105087426A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹煜成;李卓佳;文國樑;胡曉娟;徐煜;徐創(chuàng)文
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F3/34;C12R1/085
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種溶解養(yǎng)殖池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業(yè)化液體—固體復(fù)合發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化日益加劇，導(dǎo)致藍(lán)藻大量繁殖，藍(lán)藻水華高頻率爆發(fā)(曹煜成等，2007)。藍(lán)藻會大量耗氧且能釋放藍(lán)藻毒素，敗壞水質(zhì)，造成水生動物中毒死亡，對水環(huán)境和養(yǎng)殖效益造成巨大影響(彭聰聰?shù)龋?011)。有研究表明，利用溶藻菌可特異性地抑制有害微藻，達(dá)到優(yōu)化水體微藻群落的效果(王祥榮等，2010)。當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)還主要為針對海洋赤潮和湖沼水華的有害微藻種類的特性與治理等方面，YANG等篩選了溶解赤潮中肋骨條藻(Skeletonemaostatum)的溶藻菌SK-5(YANGetal,2013)，THEERASAK等篩選了殺滅引起藍(lán)藻水華的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的放線菌(THEERASAKetal,2013)，但有關(guān)運(yùn)用溶藻菌抑制池塘水體有害微藻的研究少見報道(TEEYAPORNetal,2012)。

池塘環(huán)境與開放性水體的環(huán)境差異巨大，在微藻優(yōu)勢種群結(jié)構(gòu)、水體營養(yǎng)水平、人工技術(shù)措施等方面的差別致使針對開放性水域的相關(guān)研究無法直接借鑒到養(yǎng)殖生產(chǎn)應(yīng)用中。對此，曹煜成等選用篩得的一株池塘藍(lán)藻溶藻菌—蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)CZBC1(曹煜成等，ZL201310203745.3)，蠟樣芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，廣泛存在于環(huán)境中，目前已被應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域(李煜等，2012；李俠等，2001)。陽鋼等通過向水體潑灑蠟樣芽孢桿菌BC-1有效提高了刺參的生長速度(陽鋼，2012)，何鑒堯等篩得兩株蠟樣芽孢桿菌L7和L8對螺旋鞘絲藻均有顯著地控制效果(何鑒堯，2008)。曹煜成等篩得的蠟樣芽孢桿菌CZBC1經(jīng)實驗室生態(tài)學(xué)試驗證實，其具有適應(yīng)廣溫、廣鹽、耐高pH和低耗氧的特性，可以通過直接或間接機(jī)制溶解浮游顫藻、綠色顫藻、小顫藻等有害藍(lán)藻，具有良好的顫藻溶解專一性，對其他優(yōu)良綠藻和硅藻等無溶解效應(yīng)，并且對養(yǎng)殖對蝦也無不良影響，適宜池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)應(yīng)用(曹煜成，2014)。

目前針對蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌劑的工業(yè)化液體—固體復(fù)合發(fā)酵生產(chǎn)方法還未見報道。雖然有學(xué)者就蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵工藝、溶藻菌發(fā)酵條件優(yōu)化等進(jìn)行過報道(王海云等，一株蠟樣芽胞桿菌及其制備方法、應(yīng)用，申請?zhí)?01410223612.7；朱杰等，芽孢桿菌屬溶藻菌的固體發(fā)酵與應(yīng)用，申請?zhí)?01210308126.6；孫梅等，一種巨大芽孢桿菌及其固體發(fā)酵制備菌劑的方法和應(yīng)用，申請?zhí)?01310413693.2；榮小軍等，一種蠟樣芽孢桿菌及其制劑和應(yīng)用，申請?zhí)?01010602326.3；葉姜瑜等，響應(yīng)曲面法優(yōu)化溶藻細(xì)菌發(fā)酵條件的研究，2011；許珂等，溶藻細(xì)菌W5培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵培養(yǎng))，但其中研究的溶藻菌并非上述蠟樣芽孢桿菌，并且蠟樣芽孢桿菌也不是所有菌株都具有溶藻特性的，加之有不少有關(guān)溶藻菌發(fā)酵研究的報道多為研究性質(zhì)，仍未達(dá)到菌劑的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需求，也未見相關(guān)菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種溶解養(yǎng)殖池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業(yè)化液體—固體復(fù)合發(fā)酵方法，該方法確實了液體發(fā)酵和固體發(fā)酵的工藝參數(shù)，一方面保證該方法可滿足蠟樣芽孢桿菌制劑產(chǎn)品的工業(yè)化液體—固體發(fā)酵生產(chǎn)需求，另一方面保證形成的蠟樣芽孢桿菌制劑產(chǎn)品并未因工業(yè)化和規(guī)模化的生產(chǎn)致使其溶藻特性和生長特性受到影響，仍具有良好的顫藻溶解專一性，對優(yōu)良綠藻和硅藻無溶解效應(yīng)，對養(yǎng)殖對蝦也無不良影響，菌劑產(chǎn)品可用于養(yǎng)殖生產(chǎn)應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種溶解養(yǎng)殖池塘顫藻的蠟樣芽孢桿菌制劑的工業(yè)化液體—固體復(fù)合發(fā)酵方法，包括以下步驟：

(1)確定蠟樣芽孢桿菌CZBC1液體發(fā)酵的液體培養(yǎng)基和固體發(fā)酵的固體培養(yǎng)基；

(2)菌種活化培養(yǎng)：將保種的蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)；

(3)擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化好的蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得種子液；

(4)液體發(fā)酵：將種子液接種到裝有步驟(1)中確定的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)至芽孢數(shù)量達(dá)到10¹⁰個/mL以上，得液體發(fā)酵后的種子液；

(5)固體發(fā)酵：將步驟(4)獲得的液體發(fā)酵后的種子液接種至步驟(1)中確定的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)至芽孢數(shù)量達(dá)到10⁹個/g以上，且芽孢獲得率達(dá)到90％以上，得固體發(fā)酵物；