[發(fā)明專利]檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的引物、試劑盒和方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510362507.6
• 申請(qǐng)日: 2015-06-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104894282A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡先全;李蓉;柏建山;邱德義;單振菊;周思渝;吳堅(jiān)明;蕭綺倩;邱霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蔡先全
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的引物，其特征在于該引物的序列分別為：

上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT

下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG

上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT

下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。

2.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20μL反應(yīng)體系包括以下組分：

其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT

所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG

所述上游引物CBH351F的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT

所述下游引物CBH351R的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的試劑盒，其特征在于該試劑盒中20μL反應(yīng)體系包括以下組分：

4.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA；

B、利用如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒對(duì)步驟A中的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

C、擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，并結(jié)合擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的方法，其特征在于步驟B中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序按以下步驟進(jìn)行：

(1)92℃～96℃預(yù)變性30s；

(2)92℃～95℃變性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共進(jìn)行35～45個(gè)循環(huán)；

(3)72℃延伸10s～30s。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的方法，其特征在于步驟C中所述高分辨率熔解曲線分析，按以下步驟進(jìn)行：

(1)92℃～96℃變性1min；

(2)40℃復(fù)性1min；

(3)然后初始熔解溫度60℃～65℃，開(kāi)始程序升溫熔解至90℃～95℃，并在熔解過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，15～25次/秒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米CBH351的方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品DNA的具體步驟如下：

稱取1g樣品，加入到50mL的離心管中；加入5mL?CTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混勻。65℃孵育30min，不時(shí)振蕩；吸水性大的樣品，加入CTAB提取液的量應(yīng)根據(jù)液面是否能蓋住樣品并多出少許而定；65℃過(guò)夜后,8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μL氯仿后用力振蕩，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液600μL到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μL?NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350μL氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來(lái)沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μL?70％乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50μL?TE溶液中。