[發(fā)明專利]利用DAPI嵌入和釋放模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510360782.4
• 申請日: 2015-06-26
• 公開（公告）號: CN105004703B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何丹農(nóng);顏娟;胡沖婭;金彩虹
• 申請（專利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;A61K47/26
• 代理公司: 上海東方易知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所31121
• 代理人: 唐莉莎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于DNA納米技術(shù)發(fā)展、納米材料功能化及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種通過DNA滾環(huán)擴增技術(shù)以及DNA折紙術(shù)構(gòu)建的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，同時利用有DNA雙鏈結(jié)合特性以及細胞膜穿透特性的熒光染料DAPI對DNA納米折紙結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記跟蹤，實現(xiàn)實時監(jiān)控以及模擬DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)作為藥物載體的載藥、緩釋過程，也可作為一種新的熒光定量分析方法應(yīng)用于生物分子檢測，如腫瘤的早期檢測、術(shù)后監(jiān)測評估以及細胞成像等領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，惡性腫瘤已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康及生命的重大疾病之一。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)展中國家，癌癥的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。世界各國投入大量的人力、物力用于腫瘤的預(yù)防、診斷和治療。近年來快速發(fā)展的納米生物技術(shù)，為目前抗腫瘤藥物載體領(lǐng)域提供了強有力的手段。納米材料作為新一代的藥物載體的研究正蓬勃發(fā)展，它本身能改善藥物的水溶性、提高藥物的穩(wěn)定性以及實現(xiàn)藥物緩慢控制釋放、靶向定位、以及多靶向治療等。目前利用納米顆?；蚣{米結(jié)構(gòu)作為抗腫瘤藥物載體進行抗腫瘤的研究中，使用較多的如高分子納米材料、脂質(zhì)體以及金屬納米粒子等，并且已有很多納米藥物運載系統(tǒng)成功應(yīng)用的先例，但不可否認(rèn)的是，在藥物的高效負(fù)載、靶向輸運、集治療和檢測于一體的多功能藥物載體的研究里仍然存在諸多問題，比如脂質(zhì)體的粒徑分布可能影響載體進入細胞的效率，另外一些金屬納米粒子存在生物安全方面的爭議等。因此，近幾年國際上基于DNA納米技術(shù)的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)成為新一代的抗腫瘤藥物載體的相關(guān)研究備受矚目。

DNA折紙術(shù)作為一種精確高效的自組裝技術(shù)，自2006年Rothemund發(fā)明以來在生物醫(yī)藥、高靈敏度檢測、納米光電子器件、等離子體光子學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，近年來受到廣泛關(guān)注。而目前進行DNA折紙時，多利用含7249個堿基的噬菌體單鏈M13 DNA作為腳手架鏈，同時需設(shè)計幾百條幾個堿基不等的特定序列單鏈DNA作為訂書釘鏈，然后再通過特定的折紙程序，進行不同二維納米結(jié)構(gòu)的組裝。在這過程中，實驗設(shè)計和操作復(fù)雜，訂購試劑耗資昂貴。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用DAPI嵌入和釋放模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法。

一種利用DAPI嵌入和釋放模擬DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為藥物載體的方法，其特征在于，通過DNA滾環(huán)擴增技術(shù)得到長單鏈DNA作為支架鏈，加入訂書釘鏈后進行折紙得到二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，具備DNA雙鏈強力結(jié)合能力的熒光染料嵌入其中，通過嵌入后熒光強度的增高以及DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)降解后染料釋放導(dǎo)致熒光強度下降過程監(jiān)控DNA納米折紙結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并模擬其作為抗腫瘤藥物載體的藥物負(fù)載及緩釋過程。

所述的DNA滾環(huán)擴增技術(shù)，環(huán)模板為一堿基數(shù)為96的閉合單鏈DNA，且序列為：5’-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCT GACTTC-3’。

所述的訂書釘鏈共三條，每條都能與長單鏈DNA進行互補雜交，且序列分別為，訂書釘鏈1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’；訂書釘鏈2： CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG；訂書釘鏈3： TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT。

所述的支架鏈加入訂書釘鏈后得到二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，制備條件是：高溫95℃，三分鐘，后每降0.2℃，持續(xù)20s，直至4℃。

所述的二維DNA納米折紙結(jié)構(gòu)，長度可達微米級，寬度為16nm。

所述的具備DNA雙鏈強結(jié)合能力的熒光染料，嵌入雙鏈之前熒光微弱，而嵌入后則熒光值大大增強，且能穿透細胞膜的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）。

所述的DNA納米折紙復(fù)合結(jié)構(gòu)與DAPI形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)或通過電紡技術(shù)所得的DNA納米折紙結(jié)構(gòu)膜與DAPI形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。