[發明專利]一種快速鑒定恙蟲病立克次體的LAMP引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201510358423.5
• 申請日: 2015-06-24
• 公開（公告）號: CN104988143A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 黃曦;劉澤霞
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;鄭瑩

技術領域

本發明涉及病原微生物的檢測與鑒定，具體涉及一種用環介導等溫基因擴增技術（LAMP技術）快速鑒定恙蟲病立克次體的方法。

背景技術

恙蟲病，又稱為叢林斑疹傷寒，是由恙蟲病立克次體導致的疾病，是中國最早發現的感染性疾病之一。恙蟲病立克次體呈短桿狀，平均長度1.2um，常見成雙排列，寄居于恙螨，并可經卵傳代。恙螨幼蟲需吸取人或動物的淋巴液或血液完成從幼蟲到稚蟲的發育過程，叮咬機體后可引起畏寒、發熱、叮咬處有焦痂或潰瘍、淋巴結腫大、結膜充血、皮疹等臨床癥狀。?恙蟲病廣泛流行于我國，根據流行時間，可分為夏季型和秋冬型。夏季型主要分布于南方廣東、廣西、海南等省份，秋冬型主要流行于江蘇、山東等地。恙蟲病為散發性的自然疫源性疾病，自1986年以來，恙蟲病由主要在南方流行呈現逐漸向北方擴增的流行態勢。

恙蟲病感染者早期的臨床癥狀與登革熱、瘧疾、傷寒等熱帶病極為相似。目前針對恙蟲病的病原培養性檢測比較困難，常規的血清學分型又有檢測耗時長且特異性、靈敏性差等缺點。熒光PCR等核酸檢測方法，雖然提高了檢測的靈敏度和特異性，但需要昂貴的儀器設備。以上各種方法雖然可能在臨床上提供較好的診斷價值，但由于其各自的缺點未能在臨床上大規模使用。環介導等溫基因擴增技術（Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，LAMP）是日本榮研化學株式會社于2000年前后開發出的基因擴增技術，具有快速簡便、操作準確、容易普及、安全可靠的優點，目前尚未有將LAMP法應用于快速鑒定恙蟲病立克次體。

發明內容

本發明的目的在于提供一組用于快速檢測恙蟲病立克次體的特異性引物，及一種用環介導等溫基因擴增技術（LAMP技術）快速鑒定恙蟲病立克次體的方法。本鑒定方法方便快捷、價格低廉，適于推廣應用。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

用于快速鑒定恙蟲病立克次體的特異性引物組，其特征在于，包括：

內引物1：5’-?TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3’（SEQ?ID?No.1）；

內引物2：5’-?TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3’（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-?TTGATCTGAGTATGATTGTCGG?-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3’（SEQ?ID?No.4）；

環引物1：5’-?GCAACCATACCTGTATGCC-3’?（SEQ?ID?No.5）；

環引物2：5’-?ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3’?（SEQ?ID?No.6）。

一種用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其含有上述的RT-LAMP特異性引物組。

所述引物組中，內引物、外引物、環引物的摩爾比為8：1：4。

所述用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒還包括以下成分：逆轉錄酶；（3）DNA聚合酶；?RT-LAMP反應液；顯色劑；陽性對照和陰性對照。

所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶；所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶。

所述RT-LAMP反應液含有：10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄、5mM?甜菜堿，四者的體積比為6～8：4～5：2～3：8～10。

所述顯示劑為SYBR?GREENⅠ。

所述陽性對照為含有恙蟲病立克次體保守序列的基因片段（SEQ?ID?NO.7）的質粒，陰性對照為DEPC水。

一種快速鑒定恙蟲病立克次體的方法，具體包括如下步驟：

（1）提取模板RNA；

（2）利用上述特異性引物組對模板RNA進行環介導等溫基因擴增反應；

（3）結果判斷：在上述反應管中加入2μL顯色劑10×SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現綠色則為恙蟲病立克次體，橙色則為非恙蟲病立克次體。