[發明專利]一種快速鑒定恙蟲病立克次體的LAMP引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201510358423.5
• 申請日: 2015-06-24
• 公開（公告）號: CN104988143A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 黃曦;劉澤霞
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;鄭瑩

1.用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP特異性引物組，其特征在于，包括：

內引物1：5’-?TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3’（SEQ?ID?No.1）；

內引物2：5’-?TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3’（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-?TTGATCTGAGTATGATTGTCGG?-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3’（SEQ?ID?No.4）；

環引物1：5’-?GCAACCATACCTGTATGCC-3’?（SEQ?ID?No.5）；

環引物2：5’-?ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3’?（SEQ?ID?No.6）。

2.一種用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組。

3.根據權利要求3所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述引物組中，內引物、外引物、環引物的摩爾比為8：1：4。

4.根據權利要求2或3所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，還包括以下成分：逆轉錄酶、DNA聚合酶、RT-LAMP反應液、顯色劑、陽性對照和陰性對照。

5.根據權利要求4所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶；所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶。

6.根據權利要求4所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述RT-LAMP反應液含有：10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄、5mM?甜菜堿，四者的體積比為6～8：4～5：2～3：8～10。

7.根據權利要求4所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述顯示劑為SYBR?GREENⅠ。

8.根據權利要求4所述的用于快速鑒定恙蟲病立克次體的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為含有恙蟲病立克次體（SEQ?ID?NO.7）的質粒，陰性對照為DEPC水。

9.一種快速鑒定恙蟲病立克次體的方法，其特征在于，采用權利要求2～8所述的試劑盒，加入模板RNA，在60～65℃，等溫擴增60～90分鐘，具體包括如下步驟：

（1）提取模板RNA；

（2）利用權利要求1所述的引物組對模板RNA進行環介導等溫基因擴增反應；（3）結果判斷：在上述反應管中加入2μL顯色劑10×SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現綠色則為恙蟲病立克次體，橙色則為非登恙蟲病立克次體。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，環介導等溫基因擴增反應的25μL反應體系含有：內引物1、2各8pmol/μL，外引物1、2各1?pmol/μL，環引物1、2各4?pmol/μL，反應液?12.5μL，DNA聚合酶8U，待檢RNA?1~100ng，逆轉錄酶1U，用滅菌去離子水補齊到25μL；環介導等溫基因擴增反應的條件為：60～65℃反應30～40min。