[發(fā)明專利]肝源性表達(dá)NG2的干細(xì)胞群作為種子細(xì)胞在體外3?D培養(yǎng)重建人工肝臟中的應(yīng)用及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510349918.1
• 申請(qǐng)日: 2015-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN104894066B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白蓮花;帥領(lǐng);賴潔娟;張玉君;賴向東;張宏宇;別平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797;A61L27/38
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11275
• 代理人: 王貴君

1.肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群NG2⁺HSC作為種子細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，包括如下步驟：將NG2⁺HSC注入全肝去細(xì)胞生物支架中，然后加入能使NG2⁺HSC重建為人工肝臟的條件培養(yǎng)基，模擬肝組織器官發(fā)育的微環(huán)境體外3-D培養(yǎng)，誘導(dǎo)NG2⁺HSC生成人工肝臟；

所述微環(huán)境為在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO₂條件下分階段動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，第一階段1～7天，使用CM1培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二階段8～14天，使用CM2培養(yǎng)基培養(yǎng)，第三階段15～21天，使用CM3培養(yǎng)基培養(yǎng)，每三天換培養(yǎng)基一次；培養(yǎng)過程中白天水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為20~40 rpm/min，晚上采用縱向旋轉(zhuǎn)和水平旋轉(zhuǎn)相結(jié)合的3-D旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速小于20 rpm/min；

所述CM1培養(yǎng)基為含有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4；

所述CM2培養(yǎng)基為含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、牛胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、左旋甲狀腺素、亞硒酸鈉、腐胺、孕激素、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4；

所述CM3培養(yǎng)基為含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、抑瘤素M、地塞米松、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4；

所述DMEM完全培養(yǎng)液包括如下組分：100U/mL 青霉素-G，100 μg/mL 鏈霉素，5 mM L-谷氨酰胺，1×非必須氨基酸，1×丙酮酸鈉和25 mM HEPES。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群NG2⁺HSC作為種子細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述全肝去細(xì)胞生物支架的制備方法如下：

（1）取離體全肝供體，然后從腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水洗出紅細(xì)胞；

（2）從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無菌雙蒸水去除細(xì)胞成分；

（3）從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液繼續(xù)去除細(xì)胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

（4）從門靜脈和肝動(dòng)脈灌注無菌雙蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

（5）從門靜脈和肝動(dòng)脈灌注無菌1×PBS，恢復(fù)生理狀態(tài)，制得全肝去細(xì)胞生物支架。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群NG2⁺HSC作為種子細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，其特征在于，所述全肝去細(xì)胞生物支架的制備方法如下：

（1）取離體全肝供體，然后以速度為5mL/min體內(nèi)腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水0.5小時(shí)；

（2）以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無菌雙蒸水2小時(shí)；

（3）以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小時(shí)，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的胰酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%的EDTA；

（4）以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無菌雙蒸水6小時(shí)；

（5）以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無菌1×PBS 1.5小時(shí)，制得全肝去細(xì)胞生物支架。