[發明專利]肝源性表達NG2的干細胞群作為種子細胞在體外3?D培養重建人工肝臟中的應用及方法

有效

• 申請號: 201510349918.1
• 申請日: 2015-06-23
• 公開（公告）號: CN104894066B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 白蓮花;帥領;賴潔娟;張玉君;賴向東;張宏宇;別平
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61L27/38
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 王貴君

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及肝源性表達神經-膠質抗原2陽性細胞群(NG2⁺HSC)作為種子細胞通過條件培養基微環境在體外3-D培養誘導NG2⁺HSC重建肝臟器官中的應用，還涉及利用NG2⁺HSC重建肝臟器官的方法。

背景技術

終末期肝病(End-stage liver diseae,ESLD)包括肝硬化(Liver cirrhosis)和急性肝衰竭(Acute liver failure)死亡率高，嚴重危害人類健康。而當前唯一有效治療手段是肝移植，但是肝移植又受到供體匱乏原因故難以廣泛應用。因此，尋找有效的肝臟功能替代技術是解決這一問題的關鍵。目前借助體外等暫時輔助或替代肝臟等人工肝臟方法，例如生物型人工肝臟(Bioartificial liver,BAL)和物理型人工肝臟，雖然能夠清除因肝衰竭產生或增加的各種有害物質，補充需肝臟合成或代謝的蛋白質等必須物質，改善患者水、電解質及酸堿平衡等內環境，但BAL只是暫時改善了晚期肝病患者癥狀，始終無法實現肝臟功能的全部替代。雖然近年發展的天然去細胞肝臟支架已取得進步，但由于缺乏有效的種子細胞以及誘導其生成功能性全肝器官的微環境，故使最大程度仿造原有肝臟器官以達到制成工程化的新器官的目的至今世界科學家們未能如愿以償。

為此，急需提供一種生成功能性全肝的種子細胞，通過科學培養，能夠生成工程化的新型肝臟樣器官。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供生成功能性全肝的種子細胞即NG2⁺HSC，該細胞經培養后能夠發育為類肝樣組織，并具有肝臟結構和功能；本發明的目的之二在于提供利用NG2⁺HSC細胞群在體外重建人工肝臟的方法。

為實現上述發明目的，經研究，本發明提供如下技術方案：

1、肝源性表達神經膠質抗原2的干細胞群NG2⁺HSC作為種子細胞在體外3-D培養重建人工肝臟中的應用。

本發明所指的肝源性表達神經膠質抗原2的干細胞群是表達神經-膠質抗原2(Neuro-glia antigen2，NG2)的肝源性干細胞/祖先細胞(Hepatic stem/progenitor cells，HSC)(簡稱為NG2⁺HSC)，NG2⁺HSC可以來源于胚胎期未發育成熟的肝臟，也可以來源于成體肝臟，來源于成體肝臟的表達神經膠質抗原2的干細胞群制備方法見公開號為102899291A的中國專利，也可以使用現有技術中的其他方法分離，即只要肝源性的具有發育學特性和干細胞潛能的NG2陽性細胞群同樣能夠實現本發明目的。

2、肝源性表達神經膠質抗原2的干細胞群NG2⁺HSC作為種子細胞在體外3-D培養重建人工肝臟的方法，包括如下步驟：將NG2⁺HSC注入全肝去細胞生物支架(Whole decellualrized liver scaffold，WDLS)中，然后加入能使NG2⁺HSC重建為人工肝臟的條件培養基，模擬肝組織器官發育的微環境體外3-D培養，誘導NG2⁺HSC生成(重建)人工肝臟。

本發明中的WDLS可以按照本領域現有的方法制備，優選的，所述WDLS按如下方法制備：

(1)取離體全肝供體，然后從腹主動脈灌注生理鹽水洗出紅細胞；

(2)從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水開始去除細胞成分；

(3)從門靜脈和肝動脈同時灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液繼續去除細胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

(3)從門靜脈和肝動脈灌注無菌雙蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

(4)從門靜脈和肝動脈灌注無菌1×PBS，恢復生理狀態，制得全肝去細胞生物支架。

更優選的，按如下步驟制備全肝去細胞生物支架：

(1)取離體全肝供體，然后以速度為5mL/min體內腹主動脈灌注生理鹽水0.5小時；

(2)以5mL/min速度從門靜脈和肝動脈同時灌注無菌雙蒸水2小時；