[發明專利]一種利用藍莓萊格西葉片誘導產生微不定芽的繁育方法

有效

• 申請號: 201510345506.0
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN105028193B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 王開芳;劉翠蘭;燕麗萍;孫蕾;夏陽;李麗
• 申請（專利權）人: 山東省林業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 李健康

1.一種利用藍莓萊格西葉片誘導產生微不定芽的繁育方法，步驟包括：(1)無菌試管苗培育；(2)葉片愈傷組織培養；(3)葉片微不定芽分化；(4)微不定芽成苗；(5)試管苗生根；(6)試管苗移栽；

其中：

步驟(1)所述無菌試管苗培育的方法是：選取當年生幼嫩枝條頂梢長10±1cm，去掉葉片，剪成帶2個芽莖段，消毒后接種到莖段側芽啟動培養基中，置于組培室，白天光照強度為2000～2500Lux，光照時間12～14h·d^-1，溫度25±1℃；夜間溫度18±1℃，20～25d后側芽萌發，獲得無菌苗；莖段側芽啟動培養基是指：WPM培養基+6-BA 0.3～0.5mg·L^-1+蔗糖20～25g·L^-1+瓊脂4～5g·L^-1，pH值5.4～5.6；

步驟(2)所述葉片愈傷組織培養的方法是：將步驟(1)培育的無菌苗葉片切去葉緣，沿葉脈橫著劃傷2刀，接種于培養葉片愈傷組織培養基中，置于培養箱中暗培，溫度25±1℃，15～20d后獲得葉片淡黃色愈傷組織；

步驟(3)所述葉片微不定芽分化的方法是：將步驟(2)培養的葉片淡黃色愈傷組織切成0.2～0.5cm³塊狀，轉接種到葉片微不定芽分化培養基中，以步驟(1)晝夜光照周期條件培養10～15d獲得帶有微不定芽愈傷塊；

步驟(4)所述微不定芽成苗的方法是：將步驟(3)培養的帶有微不定芽愈傷塊轉接到微不定芽成苗培養基中，以步驟(1)晝夜光照周期條件培養15～20d獲得3～5cm成苗植株；

步驟(5)所述試管苗生根的方法是：將步驟(4)獲得的成苗，將其從基部切下，接種到生根培養基中，以步驟(1)晝夜光照周期條件培養12～15d獲得生根數5～6條、根長1～2cm的生根植株；生根培養基是指：1/2WPM培養基+0.2～0.5mg·L^-1吲哚丁酸(IBA)+0.01～0.03mg·L^-1萘乙酸(NAA)+0.1～0.2mg/L玉米素(ZT)+20～25g·L^-1蔗糖+4～5g·L^-1瓊脂，pH值5.4～5.6；1/2WPM培養基是指WPM培養基組分中大量元素減半且其余為WPM全量元素，其具體組分為：NH₄NO₃ 400mg·L^-1，Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg·L^-1，K₂SO₄ 990mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 96mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.4mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，Na₂-EDTA37.3mg·L^-1，鹽酸硫胺素1.0mg·L^-1，煙酸0.5mg·L^-1，鹽酸比哆醇0.5mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1；

步驟(6)所述試管苗移栽的方法是：把步驟(5)獲得的生根植株移到溫室中適應2～3d后，用鑷子將苗輕輕夾出，放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部殘留的培養基，移栽到裝有育苗基質的營養杯中，放置于遮光度70％～80％遮蔭網溫室內，利用自動間歇噴霧裝置保持室內空氣相對濕度在85％以上，煉苗12～15d后，溫室內逐漸通風，再繼續培養12～15d，移栽的試管苗成活率90％以上；其中所述育苗基質的成分以體積比計為：蛭石:珍珠巖:草炭土＝2:3:5，且營養杯中育苗基質上面放置有1.5～2cm厚的處理過的苔蘚；

其特征在于：

葉片愈傷組織培養基是指：MSB培養基+苯基噻二唑基脲(TDZ)0.5～2.0mg·L^-1+玉米素(ZT)3.5～4.5mg·L^-1+萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg·L^-1+25～35mg·L^-1蔗糖+4～5mg·L^-1瓊脂，pH值5.2～5.4；

葉片微不定芽分化培養基是指：MSB培養基+苯基噻二唑基脲(TDZ)0.1～1.0mg·L^-1+玉米素(ZT)3.0～5.0mg·L^-1+吲哚丁酸(IBA)0.3～0.5mg·L^-1+25～35mg·L^-1蔗糖+4～5mg·L^-1瓊脂，pH值5.2～5.4；

微不定芽成苗培養基是指：WPM培養基+玉米素(ZT)3.0～5.0mg·L^-1+吲哚丁酸(IBA)0.2～0.4mg·L^-1+25～35mg·L^-1蔗糖+4～5mg·L^-1瓊脂，pH值5.2～5.4；

其中MSB培養基的組分為：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，鹽酸硫胺素10mg·L^-1，鹽酸比哆醇1.0mg·L^-1，煙酸1.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1；

WPM培養基的組分為：NH₄NO₃ 400mg·L^-1，Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg·L^-1，K₂SO₄ 990mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 96mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.4mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，鹽酸硫胺素1.0mg·L^-1，煙酸0.5mg·L^-1，鹽酸比哆醇0.5mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1。