[發明專利]一種Aβ1-42單體及其制備、鑒定方法

在審

• 申請號: 201510344975.0
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN104974242A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 岳峰;陸春玲
• 申請（專利權）人: 廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 梁山丹

技術領域

本發明涉及β-淀粉樣蛋白領域，具體涉及一種Aβ1-42單體及其制備、鑒定方法。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer’S?disease，AD)也稱為老年癡呆癥，是發生在老年期或老年前期的一種慢性、持續性、退化性的腦變性疾病，其臨床表現為記憶減退、認知障礙、人格改變等。該病的病理特征主要包括大腦皮質和海馬區域的細胞外出現以β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)為核心的老年斑、細胞內神經原纖維纏結等病變。在美國AD是僅次于心血管病、癌癥和腦卒中的第四大死亡殺手，據統計目前全世界AD發病人數高達2500萬，我國AD患者已達到600余萬，居世界首位，AD病程時間長且目前尚無徹底根治的藥物，它嚴重威脅著人類的健康，給患者及家屬帶來巨大的影響。因此建立理想及可靠的AD動物模型，對于研究和探討AD的病因、病理過程以及尋找和篩選有效藥物顯得尤為重要。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白經β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39～43個氨基酸的多肽，Aβ的大量沉積，是導致AD病人腦內老年斑周邊神經元變性和死亡的主要原因。Aβ在腦內有多種存在形式，如：低分子量Aβ單體、Aβ寡聚體、不溶性Aβ纖維體等。Aβ單體是可溶性的低分子物質，但是當胞內環境，如pH、溫度、離子濃度、蛋白濃度等改變時會誘發Aβ單體快速聚集，形成二聚體、三聚體或可溶性的Aβ寡聚體，Aβ寡聚體的穩定性較差，易向Aβ纖維體轉化。Aβ的種類分為Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43，其中Aβ1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研究Aβ1-42是當前的熱點。

近年來，有科學家提出，Aβ纖維體與記憶損害及神經細胞缺乏的關系不大，推測Aβ寡聚體、低分子量Aβ單體等可溶性Aβ可能是AD的致病因素。科學家們對Aβ1-42寡聚體做了很多研究，在建立模型時一般普遍采用Aβ1-42寡聚體直接注射方法，但目前制備、合成Aβ1-42的寡聚體均不穩定，體外容易隨機形成各種高分子量或低分子量的混合產物，這種組分不均一的復雜混合物直接影響到實驗結果的準確性和可靠性，造成無法區分是Aβ1-42寡聚體(oligomers)抑或是Aβ1-42寡聚體與單體(Monomers)的共同作用。但現有技術對Aβ1-42單體極少有報導，因此，制備成分較單一、穩定的Aβ1-42單體，可為AD的發病機制、病理過程、尋找和篩選有效藥物提供有效依據。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新合成的Aβ1-42單體及其制備、鑒定方法。本發明提供的Aβ1-42單體成分較單一、產物較穩定，在建立動物模型時，能將Aβ1-42單體作為對照組或實驗組，從而對模型的評價更為客觀與科學，為建立理想和可靠的AD模型提供良好的基礎；其制備方法簡單、收率高、省時；所采用的SDS-PAGE結合蛋白免疫印記鑒定方法，具有敏度高、特異性強、方便快速、操作簡單、費用較低等優點。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種Aβ1-42單體，所述的Aβ1-42單體主要為單體和少量寡聚體的混合物；所述單體經蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為4-4.5KD；所述寡聚體經蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為12-16KD，為三聚體和四聚體。

以上所述Aβ1-42單體，所述的Aβ1-42單體的制備方法為：取Aβ1-42合成肽，在室溫下完全溶解在HFIP中，所得溶液轉移到離心管中，用干浴氮吹儀使HFIP徹底吹干；加入DMSO使離心管底部的固體完全溶解，再加入HEPES緩沖液，混勻；在溫度為37℃條件下震蕩24小時，轉速600轉/分鐘，即得。

以上所述Aβ1-42單體的制備方法，包括以下步驟：

1.將1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL?HFIP中，在室溫下靜置30-60分鐘，得到完全溶解的溶液；

2.將步驟1得到的溶液轉移到硅化的離心管中，在干浴氮吹儀上吹8-15分鐘，使HFIP徹底吹干，得到透明片狀固體沉于管底；

3.在所述離心管中加入40μl?DMSO，使離心管底部的固體完全溶解，再加入pH值為7.4的濃度為l0mM?HEPES緩沖溶液，使溶液最后終體積為1ml，混合均勻；

4.將步驟3得到的溶液在溫度為37℃條件下震蕩24小時，轉速600轉/分鐘，即得。

一種以上所述Aβ1-42單體的鑒定方法，包括以下步驟：