[發(fā)明專利]一種Aβ1-42單體及其制備、鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510344975.0
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN104974242A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 岳峰;陸春玲
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 梁山丹

1.一種Aβ1-42單體，其特征在于：所述的Aβ1-42單體主要為單體和少量寡聚體的混合物；

所述單體經(jīng)蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為4-4.5KD；

所述寡聚體經(jīng)蛋白免疫印記法電泳鑒定：分子量為12-16KD，為三聚體和四聚體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述Aβ1-42單體，其特征在于，所述的Aβ1-42單體的制備方法為：取Aβ1-42合成肽，在室溫下完全溶解在HFIP中，所得溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，用干浴氮吹儀使HFIP徹底吹干；加入DMSO使離心管底部的固體完全溶解，再加入HEPES緩沖液，混勻；在溫度為37℃條件下震蕩24小時，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，即得。

3.一種如權(quán)利要求1或2所述Aβ1-42單體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL?HFIP中，在室溫下靜置30-60分鐘，得到完全溶解的溶液；

（2）將步驟（1）得到的溶液轉(zhuǎn)移到硅化的離心管中，在干浴氮吹儀上吹8-15分鐘，使HFIP徹底吹干，得到透明片狀固體沉于管底；

（3）在所述離心管中加入40μl?DMSO，使離心管底部的固體完全溶解，再加入pH值為7.4的濃度為l0mM?HEPES緩沖溶液，使溶液最后終體積為1ml，混合均勻；

（4）將步驟（3）得到的溶液在溫度為37℃條件下震蕩24小時，轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，即得。

4.一種如權(quán)利要求1或2所述Aβ1-42單體的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳：取Aβ1-42單體溶液2μL，與18μL?4X電泳上樣緩沖液混合均勻，然后上樣，電泳上樣量為5ul/泳道，電泳用的膠為4–12%的梯度膠，同時在一個泳道加入10μL分子量為3.6-260KD的預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)品，電泳時選擇80V電壓電泳30-40分鐘,然后轉(zhuǎn)100v電壓繼續(xù)電泳2小時；

（2）轉(zhuǎn)膜：將電泳好的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，半干法轉(zhuǎn)膜，時間為6分鐘,將轉(zhuǎn)好的PVDF膜按加樣泳道的大小裁剪，然后將剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分鐘；

（3）封閉：再將PVDF膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，搖床上慢速振蕩，室溫條件下封閉1小時；

(4)洗膜：將步驟（3）得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗2-3次，每次5分鐘；

(5)一抗孵育：將步驟（4）得到的PVDF膜浸泡在含有6E10的一抗溶液中，室溫下孵育1小時；

(6)洗一抗膜：將經(jīng)過一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6次，每次5分鐘；

(7)二抗孵育：將漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中室溫下孵育1小時；

(8)洗二抗膜：將經(jīng)過二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在搖床上震蕩漂洗6次，每次5分鐘；

(9)化學(xué)發(fā)光曝光：將HRP底物液均勻加在經(jīng)步驟（8）漂洗過的PVDF膜上，在5-30秒內(nèi)分別進(jìn)行暗室曝光顯影，從中選擇條帶清晰的膠片作為最后結(jié)果。