[發明專利]能夠鑒定吳江香青菜的ISSR?SCAR標記及其鑒定方法

有效

• 申請號: 201510344812.2
• 申請日: 2015-06-19
• 公開（公告）號: CN104894124B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發明（設計）人: 林一波;張艷梅;沈雪林;孫小芹;戴華軍;杭悅宇;曹敏旭
• 申請（專利權）人: 蘇州市種子管理站
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 曹毅

技術領域

本發明屬于分子標記鑒定領域，特別涉及一種能夠鑒定吳江香青菜的ISSR-SCAR標記及其鑒定方法。

背景技術

青菜（Brassica chinensis L.）也叫小白菜、不結球白菜，屬十字花科蕓薹屬，為一年生或二年生草本，是重要的蔬菜和油料作物。青菜原產中國，但是近年來東南亞及歐美等一些國家也逐步引種栽培，目前成為世界性的蔬菜。其中香青菜不僅是我國獨有的青菜品種，而且是蘇州地方傳統特色珍稀蔬菜品種。至今已有100多年的栽培歷史，主要種植在沿東太湖及太湖西南岸，涉及吳江的震澤、橫扇、七都、桃源以及松陵、平望、盛澤等鎮的部分地區。由于吳江香青菜香味濃郁，品質柔嫩，風味獨特，其優勢別的地方無法復制，2009年，經農業部評定，吳江香青菜成為江蘇省省首批、蘇州市第一個國家農產品地理標志登記保護的農產品。目前對吳江香青菜的鑒別主要依據其形態學特征，如植株半披張、葉片長橢圓形、葉緣程淺波紋皺褶、葉面鄒成波狀突起等。但由于大部分青菜品種苗期相似，直到成株才開始表現出品種的特性，所以對其品種的鑒定往往需要一定時間。因此，為了更加有效地區分外形相似的不同青菜品種，保護地理標志產品的種質資源，開發出穩定、準確地鑒別地理標志產品的技術體系迫在眉睫。

近年來，DNA分子標記技術逐步成熟和完善，在遺傳圖譜構建、品種鑒定、親緣關系分析和基因定位等方面得到了廣泛的應用。目前常用的DNA分子標記主要有基于DNA分子雜交的RFLP、小衛星DNA等和基于PCR反應的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中序列特異性擴增區域（Seqμence characterized amplified regions, SCARs）標記通常是由RAPD、SRAP、ISSR標記轉化而來，是將上述分子標記篩選出的特異標記片段進行克隆和測序，根據其堿基序列設計一對特異引物，用于對特征擴增區域的特異性擴增。SCAR標記一般表現為擴增片段的有無，是一種顯性標記，具有穩定性好、可重復性強等優點，目前已成為育種實踐中能直接應用的首選標記。

雖然目前DNA分子標記技術在青菜中已取得了一定的研究成果，但主要集中在遺傳多樣性和遺傳圖譜構建方面，在品種鑒定方面的報道大多是通過SSR指紋圖譜對青菜品種進行鑒別，但由于該方法操作繁瑣、重復性差，并且不是可直接應用的專一性、特異性分子標記，因此不適合用于穩定、快速、準確的品種鑒別體系的開發。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠鑒定吳江香青菜的ISSR-SCAR標記及其鑒定方法，通過提供鑒別吳江香青菜的一個DNA片段、一組特異性鑒別引物和一種鑒別方法，實現對吳江香青菜品種的特異性鑒定，為保護地理標志產品的種質資源提供有力的技術支持。

本發明采用的技術方案是：

本發明涉及一個能夠在吳江香青菜中擴增出特異性條帶的ISSR引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示。

本發明所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的引物是通過22條ISSR引物對香吳江青菜和其它10種江淮地區主栽的青菜品種（包括上海青、小八葉、黑心烏、中其白、蘇州青、五月慢、高梗白、矮腳黃、四月慢和黃心烏）進行PCR擴增，篩選出的能夠在吳江香青菜中擴增出特異性條帶的引物。

本發明涉及一個吳江香青菜特異性DNA片段，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發明所述核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示的基因是使用核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的引物在吳江香青菜中擴增出的一條特異性條帶，該擴增條帶只出現在吳江香青菜中，而在其它青菜品種中沒有。將該特異性條帶進行克隆和測序獲得其核苷酸序列。

本發明涉及一組特異性鑒別吳江香青菜的SCAR引物，其中上游引物為SEQ ID NO.3，下游引物為SEQ ID NO.4，分布對應于SEQ ID NO.2片段的11-33nt及1168-1191nt位點。

本發明提供一種吳江香青菜的DNA分子鑒別方法，其特征在于利用特異性鑒別吳江香青菜的SCAR引物對待檢青菜品種的10個個體DNA樣品進行PCR反應，PCR反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在1181bp處出現擴增條帶的樣品為吳江香青菜，而相同部位沒有出現條帶的樣品不是香青菜。