[發(fā)明專利]溫度敏感型載體pBBR1MCS?2?Ts3及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510340762.0
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號(hào): CN104894155B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃建忠;江賢章;周芬;劉洪嬌;祁峰;張明亮;陶勇
• 申請（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/63
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts3及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的工具叫載體(Vector)。質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體，質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。一個(gè)理想的載體大致應(yīng)有下列一些特性：(1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；(2)具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)；(3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標(biāo)記，便于鑒定和篩選；(5)對宿主細(xì)胞無害。

寬宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-2是應(yīng)用性很廣的載體，該質(zhì)粒由pBBR1質(zhì)粒改造而來。pBBR1質(zhì)粒來源于革蘭氏陰性菌Bordetella bronchiseptica S87(Antoine R and Locht C.Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms.Mol Microbiol.1992,6(13):1785-1799)。pBBR1MCS-2含有一個(gè)卡那霉素(kan)抗性篩選標(biāo)記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質(zhì)粒適用于DNA克隆、蛋白表達(dá)，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。

溫度敏感型質(zhì)粒載體可以方便的控制質(zhì)粒在宿主中的存在。當(dāng)溫度比較低時(shí)，質(zhì)粒可以存在宿主中，而當(dāng)溫度提高后，溫度敏感型質(zhì)粒載體將丟失或整合到染色體上。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何構(gòu)建溫度敏感型載體。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了構(gòu)建重組載體的方法。

本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組載體的方法，為構(gòu)建重組載體的方法1，是將SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達(dá)盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBR1MCS-2-Ts3；

所述目的基因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)進(jìn)行A3)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質(zhì)得到的蛋白質(zhì)，即所述目的基因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID No.8所示的蛋白質(zhì)；A3)為將SEQ ID No.2第86位的Arg突變?yōu)镃ys。

上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒中的目的基因?yàn)閷EQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進(jìn)行B3)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；B3)為將SEQ ID No.1第2049位的C突變?yōu)門。

其中，SEQ ID No.1由5145個(gè)核苷酸組成，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸為rep的編碼基因，編碼SEQ ID No.2所示的rep蛋白。

上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒的序列可為SEQ ID No.7。

其中，SEQ ID No.7的第238-900位編碼SEQ ID No.8所示的蛋白質(zhì)。

上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為將SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子進(jìn)行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子：

C2)如下C21)和/或C22)：

C21)將SEQ ID No.1第1732位的A突變?yōu)镚；

C22)將SEQ ID No.1第1780位的G突變?yōu)門；

C3)如下C31)和/或C32)：

C31)將SEQ ID No.1第1747位的C突變?yōu)門；

C32)將SEQ ID No.1第1776位的T突變?yōu)锳；

C4)將SEQ ID No.1第1751位的T突變?yōu)锳；