[發(fā)明專利]一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510340234.5
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN104974953A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭狄
• 申請（專利權(quán)）人: 中山鼎晟生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

1.?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備微囊藻毒素粗品：取天然水華的新鮮藍(lán)藻5-10g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎1-2h，離心，取上清液；取濾渣重復(fù)萃取3-5次，合并上清液，采用0.45um微孔濾膜過濾，將濾液采用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH至7.5-8后經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾，在30-60℃條件下蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液采用0.45um微孔濾膜過濾，制得微囊藻毒素粗品；

（2）采用C18固相萃取柱進(jìn)行洗脫制備微囊藻毒素純品：將步驟（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上樣，先用20-50ml蒸餾水洗脫，再用20-50ml?20-35%的甲醇洗脫，最后用?40-60ml??40-80%的甲醇洗脫，利用柱層析系統(tǒng)分離、純化，將純化液移至玻璃定量管中，常溫下離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑，制得微囊藻毒素產(chǎn)品；

（3）微囊藻毒素的測定：采用微囊藻毒素檢測試劑盒檢測步驟（2）中制備的微囊藻毒素產(chǎn)品，將太湖腐爛的水華上清液添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28-30℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)富集培養(yǎng)3次，根據(jù)菌落性狀不同進(jìn)行分離純化；

（4）采用基因組提取試劑盒對提取菌株基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所有菌株的16SrRNA基因通過軟件比對，采用最大似然法與最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對基因序列采用Blast錄入，觀察該菌株所在分支，判斷篩選菌株與已知菌株親緣關(guān)系，并將該菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40℃，Ph為7-8，觀察該菌株生理生化特性，根據(jù)篩選菌株與已知菌株親緣關(guān)系及其生理生化特性對該菌株進(jìn)行鑒定；

（5）觀察篩選菌株對微囊藻毒素的降解能力：將篩選菌株與惡臭假單胞菌接種至底物為初始濃度為15.4ng/L的M9培養(yǎng)基中，連續(xù)5d每24h取樣1次，上清液以微孔濾膜過濾后，測定微囊藻毒素含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（1）中所述的磁力攪拌的速度為2000-2500r/min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（1）中所述的提取溶劑選自50-80%的甲醇水溶液或酸溶液中的一種或多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，所述的酸溶液選自2-5%的的甲酸溶液、2-5%的乙酸溶液或5-10%的三氯乙酸中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，所述的提取液為體積比為（30-40）：（60-70）的5%的乙酸溶液與80%的甲醇水溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（1）與步驟（2）中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20-30min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（3）中所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為添加了1-3mg/L的微囊藻毒素的培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（2）中所述的柱層析系統(tǒng)參數(shù)為：層析柱直徑2-4cm，長20-40cm，填料為15-20umC18硅膠，流動相為體積比為（30-45）:（50-60）:（0.03-0.12）的水、甲醇及乙酸；流速為2-5ml/min;?進(jìn)樣體積為2-5ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的?一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（3）中所述的富集培養(yǎng)3次后的培養(yǎng)基中微囊藻毒素濃度依次為5-10?mg/L、10-20?mg/L、20-40?mg/L。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的????一種天然水華藍(lán)藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,其特征在于，步驟（4）中所述的PCR引物采用細(xì)菌通用引物，所述的PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性?5?min?,?94℃變性?30?s?,?55℃退火?30?s?,?72℃延伸?45?s?,?38個循環(huán),?最后?72℃延伸10?min?,?4℃保存；反應(yīng)結(jié)束后,?取?5μL?反應(yīng)液經(jīng)1.?2%瓊脂糖電泳?,?EB?染色?,紫外檢測。