[發(fā)明專利]一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510340234.5
• 申請日: 2015-06-18
• 公開（公告）號: CN104974953A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發(fā)明（設計）人: 郭狄
• 申請（專利權）人: 中山鼎晟生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術領域

本發(fā)明屬于生物分析領域，具體涉及一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定。

背景技術

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由淡水藍藻中的微囊藻、顫藻及念珠藻等幾類主要的淡水藍藻產生的最常見的毒素。微囊藻毒素的主要結構為環(huán)?D-?丙氨酸-?R1-?R2-?赤-?β-?甲基-?D-?異天冬氨酸-?L-?Z-adda-?D-?異谷氨酸-?N-?甲基脫氫丙氨酸，至今已發(fā)現?80?種以上的微囊藻毒素異構體。微囊藻毒素主要是對兩種蛋白磷酸酶（PP-1和PP-2A）的活性，從而產生強烈的肝毒性及誘發(fā)癌癥，對哺乳動物具有極大的威脅。在所有淡水藍藻產生的毒素中，微囊藻可能是危害最嚴重的，它常在富營養(yǎng)化的淺湖泊或池塘中大量發(fā)生。

近來隨著人類生活方式的改變，城鎮(zhèn)工業(yè)的迅速發(fā)展和城市人口的增加，生活污水和部分工業(yè)廢水大量注入湖泊致使湖泊漸漸富營養(yǎng)化。水體環(huán)境富營養(yǎng)化引起的藍藻水華問題在我國已日趨嚴重，淡水湖泊如滇池、太湖和巢湖，每年夏秋季都會爆發(fā)高濃度的藍藻水華，對水體生態(tài)系統和人類健康帶來直接或潛在的嚴重危害。物理化學方法治理微囊藻毒素污染耗費大量財力物力,?并且治標不治本,?甚至還有可能對水體造成二次污染?,而微生物去除微囊藻毒素具有成本低、安全性強、利于生態(tài)修復等優(yōu)點?,?是一種去除微囊藻毒素很有前途的方法。目前，已報道的降解微囊藻毒素純菌株有鞘氨醇單胞菌、銅綠假單胞菌、伯克氏菌等多種鞘氨醇單胞菌屬，但此類菌株對微囊毒素的降低作用十分有限，研究顯示，采用惡臭假單胞菌降解微囊毒素時，5d后的降解率僅為55.3%。為此，本發(fā)明提供一種微囊毒素降解能力更強的菌株，以期為微囊藻毒素的微生物降解提供更好的更高效的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是解決現有技術中存在的上述問題，提供一種微囊毒素降解能力更強的菌株，且該菌的篩選成本低，可滿足實際大量應用的需求。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種天然水華藍藻中微囊藻毒素的降解菌的分離與鑒定,包括以下步驟：

（1）制備微囊藻毒素粗品：取天然水華的新鮮藍藻5-10g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎1-2h，離心，取上清液；取濾渣重復萃取3-5次，合并上清液，采用微孔濾膜過濾，將濾液采用PH調節(jié)劑調節(jié)PH至7.5-8后經0.45um微孔濾膜過濾，在30-60℃條件下蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液采用0.45um微孔濾膜過濾，制得微囊藻毒素粗品；

（2）采用C18固相萃取柱進行洗脫制備微囊藻毒素純品：將步驟（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上樣，先用20-50ml蒸餾水洗脫，再用20-50ml?20-35%的甲醇洗脫，最后用?40-60ml??40-80%的甲醇洗脫，利用柱層析系統分離、純化，將純化液移至玻璃定量管中，常溫下離心，取上清液旋轉蒸發(fā)蒸干溶劑，制得微囊藻毒素產品；

（3）微囊藻毒素的測定：采用微囊藻毒素檢測試劑盒檢測步驟（2）中制備的微囊藻毒素產品，將太湖腐爛的水華上清液添加于基礎培養(yǎng)基中，28-30℃恒溫培養(yǎng)，連續(xù)富集培養(yǎng)3次，根據菌落性狀不同進行分離純化；

（4）采用基因組提取試劑盒對提取菌株基因組DNA，進行PCR擴增，將所有菌株的16SrRNA基因通過軟件比對，采用最大似然法與最大簡約法構建系統發(fā)育樹，并對基因序列采用Blast錄入，觀察該菌株所在分支，判斷篩選菌株與已知菌株親緣關系，并將該菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40℃，Ph為7-8，觀察該菌株生理生化特性，根據篩選菌株與已知菌株親緣關系及其生理生化特性對該菌株進行鑒定；

（5）觀察篩選菌株對微囊藻毒素的降解能力：將篩選菌株與惡臭假單胞菌接種至底物為初始濃度為15.4ng/L的M9培養(yǎng)基中，連續(xù)5d每24h取樣1次，上清液以微孔濾膜過濾后，測定微囊藻毒素含量。

優(yōu)選的，步驟（1）中所述的磁力攪拌的速度為2000-2500r/min。

優(yōu)選的，步驟（1）中所述的提取溶劑選自50-80%的甲醇水溶液或酸溶液中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述的酸溶液選自2-5%的的甲酸溶液、2-5%的乙酸溶液或5-10%的三氯乙酸中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述的提取液為體積比為（30-40）：（60-70）的5%的乙酸溶液與80%的甲醇水溶液。

優(yōu)選的，步驟（1）與步驟（2）中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20-30min。