[發明專利]柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201510330728.5
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN104862426B
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 劉科宏;周常勇;李中安;陳洪明;周彥
• 申請（專利權）人: 西南大學柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種環介導等溫擴增分子檢測方法，尤其涉及一種柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

柑桔褪綠矮化病由柑桔褪綠矮化相關病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)引起，CCDaV屬于菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)，為單鏈環狀的DNA病毒，基因組為3.4-3.6kb，具有5個ORFs。柑桔褪綠矮化病主要分布于土耳其，近年來我國相繼在云南、四川等地發現了柑橘褪綠矮化病，其發生呈不斷擴大、加重的趨勢，可通過楊梅粉虱(Parabemisia myricae Kuwana)傳播。CCDaV可侵染多種柑桔寄主，如葡萄柚、檸檬、椪柑、酸橙及甜橙等，引起植株葉片變形、扭曲、花葉等癥狀，并造成果實變小，產量降低。該病在土耳其被認為是威脅柑桔生產最嚴重病害之一，且已經在土耳其造成了嚴重的損失，特別是在梅爾辛造成當地柑桔減產60～70％。

目前我國柑桔的種植面積和產量均居世界第一，柑桔已成為我國農民增收的重要途徑，也是我國一個重要的產業。柑桔褪綠矮化病已在我國時有發生，且日趨嚴重，對柑桔產業是一個巨大的威脅，且該病目前尚無有效的藥物可進行防治，因此柑桔褪綠矮化病的防控對我國柑桔產業的發展具有十分重要的意義。

柑桔褪綠矮化病的檢測，目前可用的方法有：常規PCR和實時熒光PCR。PCR法具有快速、靈敏和準確的特點，作為一種強有力的檢測工具已廣泛應用于各種病害的檢驗與診斷，實時熒光PCR的靈敏度高于常規PCR。PCR方法雖然能對CCDaV進行有效的檢測，但都需要專業的PCR儀、電泳儀等特殊儀器，使其在田間和基層的應用受到很大的限制。因此建立一套快速、有效、簡便的柑桔褪綠矮化病的檢測方法，對我國柑桔產業健康、穩定發展具有十分重要的意義。

2000年由Notomi等發明的環形介導逆轉錄等溫擴增技術(LAMP)是一種新的恒溫核酸擴增方法，較傳統的核酸擴增方法具有靈敏度高、特異性強、操作方法簡單、快速等優點，現已越來越多的應用于各種病毒的檢測。其主要原理是通過采用特異地識別靶序列上6個區域的4條引物(2條內引物-FIP/BIP，2條外引物-F3/B3)及鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等溫條件下(60-65℃左右)DNA開始合成。利用可以產生環狀結構的引物和Bst DNA聚合酶的鏈置換合成活性，靶序列兩端引物結合處循環不斷地產生環狀單鏈結構。當一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈解離變成單鏈，引物在恒溫條件下不斷引發新鏈的合成，靶基因因此得到高效擴增，最終的擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳顯現出不同大小條帶組成的階梯式圖譜。該方法可加入熒光燃料進行可視化判斷也可根據渾濁度判斷檢測結果，反應也不需要特殊儀器，在烘箱或水浴鍋中就能完成反應，因此特別適合在田間和基層使用。

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高的柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP引物組。

一種柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測引物組，由外引物對F3、B3和內引物對FIP、BIP組成：

外引物對：

F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；

B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；

內引物對：

FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；

BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。

本發明的另一目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性的柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測試劑盒。

一種柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測試劑盒，含有前述的柑桔褪綠矮化相關病毒的LAMP檢測引物組、Bst buffer、MgCl₂、Betaine、dNTPs、Bst聚合酶。

本發明還提供了一種不需要專門的核酸擴增和檢測儀器、操作簡單方便、特異性好、靈敏度高、檢測快速的柑桔褪綠矮化相關病毒LAMP檢測方法。