[發明專利]兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系及其分離方法和應用

在審

• 申請號: 201510330647.5
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN105274059A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 謝小明;林小提;劉遠芳;唐海林;劉曉萍;楊露;劉鵬;葉鋒;謝新華
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

1.兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，是通過以下方法分離得到的：

(1)、取用剛切除的乳腺癌腫瘤標本，先經膠原酶消化處理，再過濾；

(2)、流式細胞儀分選出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的細胞，調節要求細胞純度在98％以上；

(3)、配置乳腺癌干細胞培養劑，將步驟(2)中分選出的細胞經單克隆篩選后接種于含有乳腺癌干細胞培養劑的超低粘附的培養皿中，在原代培養中加入青霉素及鏈霉素雙抗，于CO₂培養箱培養即得到兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系。

2.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(1)所述的經膠原酶消化處理，具體是使用膠原酶III，每毫升組織液中加入250單位膠原酶III，再置于37℃恒溫培養箱中培養4小時。

3.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(1)所述的過濾，為使用40mm濾網進行過濾。

4.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(2)所述的乳腺癌干細胞培養劑，其配方為：在無血清DMEM-F12中加入10ng/mL堿性成纖維生長因子、20ng/mL表皮生長因子、2％B27及5ug/mL胰島素。

5.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(2)所述的單克隆篩選，方法為：按重度1：2有限稀釋法稀釋至單一細胞，并將細胞分散滴加于96孔板中，顯微鏡下觀察確認為單一細胞者進一步培養。

6.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(3)中所述的青霉素，其添加量為100U/mL，所述的鏈霉素，其添加量為0.1mg/mL。

7.根據權利要求1所述的兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，步驟(3)所述的CO₂培養箱為5％CO₂培養箱。

8.權利要求1所述的在兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系制備治療乳腺癌藥物中的應用。