[發明專利]兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系及其分離方法和應用

在審

• 申請號: 201510330647.5
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN105274059A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 謝小明;林小提;劉遠芳;唐海林;劉曉萍;楊露;劉鵬;葉鋒;謝新華
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

技術領域：

本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系及其分離方法和應用。

背景技術：

乳腺癌是女性第一大惡性腫瘤，發病率逐年增高。據美國癌癥協會(ACS)2012年數據統計，美國新增診斷病例23萬，增長了29％，死亡病例4萬，增長14％。我國隨著生活方式改變，城市化進程加快，以及乳腺鉬靶X線檢查的推廣，每年新檢測出的病例逐年上升，中國上海乳腺癌發病率由1972年的17/10萬升至2007年的69.22/10萬。同時，中國乳腺癌的發病情況相對于西方國家呈現出年輕化的特征。大多數西方國家乳腺癌的發病高峰年齡出現在60歲以后。在中國，乳腺癌的發病高峰年齡則出現在45-50歲左右，提前了10至15年。其病理類型更趨向侵襲能力強的類型，愈后更差。地區分布上，患病率城市高于農城，經濟發達地區高于經濟落后地區。隨著社會老年化，乳腺癌患者人數將更多，預計2011年我國乳腺癌新發病例110萬，2021年達250萬。這意味著在我國，乳腺癌已經嚴重危害了廣大處于事業和家庭巔峰時期的女性的生命和生活，成為威脅女性健康的“首要殺手”。其對人類健康的嚴重危害已引起了世界衛生組織和醫療界人士的高度重視。腫瘤干細胞具有干細胞特性，能進行自我更新和多向分化，對腫瘤的形成、生長、耐藥、復發和轉移起著決定性的作用，是腫瘤治療的難點所在。具有自我更新和分化能力，在不斷分裂過程中更有可能獲得多次突變的機會而變成惡性繁殖的腫瘤細胞，從而產生腫瘤。而這些腫瘤干細胞又與腫瘤的耐藥、復發和轉移息息相關。因此，殺滅腫瘤干細胞已成為一種新的腫瘤治療策略。然而，據我們所知，目前尚無任何實驗室建立起可穩定傳代的臨床來源的乳腺癌干細胞系，故爾，迫切需要建立起臨床來源的可穩定傳代的乳腺癌干細胞系并應用于臨床及科學研究。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，是通過以下方法分離得到的：

(1)、取用剛切除的乳腺癌腫瘤標本，先經膠原酶消化處理，再過濾；

(2)、流式細胞儀分選出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的細胞，調節要求細胞純度在98％以上；

(3)、配置乳腺癌干細胞培養劑，將步驟(2)中分選出的細胞經單克隆篩選后接種于含有乳腺癌干細胞培養劑的超低粘附的培養皿中，在原代培養中加入青霉素及鏈霉素雙抗，于CO₂培養箱培養即得到兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，分別命名為XM322和XM607。

步驟(1)所述的經膠原酶消化處理，優選使用膠原酶III，每毫升組織液中加入250單位膠原酶III，再置于37℃恒溫培養箱中培養4小時。

步驟(1)所述的過濾，優選使用40mm濾網進行過濾。

步驟(2)所述的乳腺癌干細胞培養劑，優選，其配方為：在無血清DMEM-F12中加入10ng/mL堿性成纖維生長因子、20ng/mL表皮生長因子、2％B27及5ug/mL胰島素。

步驟(2)所述的單克隆篩選，優選方法為：按重度1：2有限稀釋法稀釋至單一細胞，并將細胞分散滴加于96孔板中，顯微鏡下觀察確認為單一細胞者進一步培養。

步驟(3)中所述的青霉素，其添加量優選為100U/mL，所述的鏈霉素，其添加量優選為0.1mg/mL。

步驟(3)所述的CO₂培養箱，優選為5％CO₂培養箱。

所述的流式細胞儀分選出CD44⁺,CD24^-和ALDH1⁺的細胞按現有技術常規操作。

本發明的第二個目的是提供兩株可穩定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系在制備治療乳腺癌藥物中的應用。