[發明專利]一種基于足點域和雜交鏈式反應測定T?2毒素的方法

有效

• 申請號: 201510324989.6
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN105021593B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 混旭;王林鵬;王周平
• 申請（專利權）人: 青島科技大學;江南大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司37241
• 代理人: 萬桂斌

1.一種基于足點域和雜交鏈式反應測定T-2毒素的方法，包括以下步驟：

(1)取10μL鏈霉親和素修飾磁珠至1mL離心管中，并用100μL pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液清洗兩遍，并分散到100μL的Tris-HCl緩沖溶液中；發卡DNA在使用之前在95℃條件下孵化2min，然后逐步降溫至室溫備用；

(2)在盛有10μL磁珠的1mL的離心管中加入100μL pH 6.8的磷酸緩沖溶液，然后加入10μL 1.0×10^-5M生物素化的Seq.16，并在37℃下振蕩反應1h，然后，再加入10μL 1.0×10^-5M DNA1，得到Seq.16/DNA1修飾的磁珠，并用磷酸緩沖溶液洗滌3遍，并分散于100μL的磷酸緩沖溶液中；

(3)在盛有10μL磁珠的1mL的離心管中加入100μL pH 6.8的磷酸緩沖溶液，然后加入10μL 1.0×10^-5M的DNA2，并在37℃下振蕩反應1h，得到發卡DNA2修飾的磁珠，用磷酸緩沖溶液洗滌3遍，并分散于100μL的磷酸緩沖溶液中；

(4)在100μL含有Seq.16/DNA1修飾的磁珠溶液中加入T-2毒素的樣品溶液100μL，在37℃下振蕩反應，T-2毒素與Seq.16作用，使得DNA1脫離Seq.16/DNA1修飾的磁珠表面，1h后，磁性分離，取含DNA1的清液加到100μL發卡DNA2修飾的磁珠溶液中，37℃下振蕩反應，DNA1的3’端與DNA2的5’端單鏈部分雜交形成足點域，在足點域的作用下DNA1未雜交的部分與DNA2雙鏈部分繼續進行雜交反應，將DNA2的發卡結構打開，并形成新的雙鏈DNA，1h后，加入100μL 1.0×10^-7M FITC-H1和1.0×10^-7M FITC-H2的溶液，并在37℃振蕩反應1h；然后，進行磁性分離，除去清液后，將磁珠用100μL pH 6.8的磷酸緩沖溶液清洗兩遍，然后分散于100μL pH 6.8的磷酸緩沖溶液中；取200μL pH 11.3濃度為0.01M的魯米諾溶液于小燒杯中，并加入上述所得50μL磁珠溶液；打開光二極管電源，照射15秒后關閉電源，測定化學發光強度，根據化學發光強度實現目標物的測定。

2.權利要求1的一種基于足點域和雜交鏈式反應測定T-2毒素的方法，其特征在于所述的DNA部分序列如下：

Seq.16:5’-biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTG TTT ACA CAT GCG AGA GGT GAA GAC TCG AAG T-3’

DNA1:5’-GGA TCA CAG GAT CAA GCT TC-3’；

DNA2：5’-GAA GCT TGA TCC TGT GAT CCT AGC ACC TAG ATC GAC GTA GGC TAG GAT CAC AGG AT-3’；

FITC-H1：5’-FITC-GCT AGG ATC ACA GGA TGT GTG TCC AGT GCA AAA TCC TGT GAT CCT AGC CTA CGT CGA TCT AGG T-3’；

FITC-H2:5’-TTT GCA CTG GAC ACA CAT CCT GTG ATC CTA GCA CCT AGA TCG ACG TAG GCT AGG ATC ACA GGA T-FITC-3’。