[發明專利]基于IPMA的小反芻獸疫病毒抗體檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201510324242.0
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN104991061B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 步志高;劉文興;陳偉業
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司11021
• 代理人: 陳曉娜

技術領域

本發明提供一種基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗(immunoperoxidase?monolayer?assay，IPMA)的小反芻獸疫病毒抗體檢測試劑盒，所述試劑盒能夠高特異性高靈敏度地檢測小反芻動物體內是否存在小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)抗體，從而達到疫苗抗體檢測或疾病診斷的目的。

背景技術

小反芻獸疫是小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)感染引起的一種嚴重的烈性、接觸性傳染病，會造成重大的經濟損失。該病為FAO/OIE規定的A類烈性傳染病，我國規定的一類動物疫病。

其病原是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員，基因組為不分節段的單股負鏈RNA。與牛瘟病毒有相似的物理化學及免疫學特性。病毒可在胎綿羊腎、胎羊及新生羊的睪丸細胞、Vero細胞上增殖，并產生細胞病變(CPE)，形成合胞體。只有一個血清型，但從遺傳演化上，可分為4個系。

該病自1942年在西非象牙海岸首次報道以來，目前主要流行于非洲西部、中東部和亞洲的部分地區。2007年首次由境外傳入我國西藏，次年西藏又有傳染來源不明的疫情，2013年底新疆再次發生，目前已有20各省市區出現疫情。傳染途徑主要為直接、間接接觸或呼吸道飛沫傳播。傳染源主要為患病動物和隱性感染動物，處于亞臨床型的病羊尤為危險。其中病畜的分泌物和排泄物均能攜帶病毒。

PPRV主要感染小反芻獸，山羊比綿羊更易感，其它野生動物也可發生。臨床上以發熱、眼鼻分泌物、口炎、腹瀉和肺炎為特征。發病率和死亡率分別可高達100％和90％，其中幼畜一般高于成年家畜。還常伴有繼發的呼吸道和胃腸道感染。

對患畜尸體剖檢，可見結膜炎、壞死性口炎，嚴重病例可蔓延到硬腭及咽喉部。皺胃、腸(尤其結直腸結合處)常出現糜爛、出血。淋巴結腫大，脾有壞死性病變。在鼻甲、喉、氣管等處有出血斑。

該病的初步診斷，可根據臨床癥狀和病理變化作出判斷，而確診需進行實驗室檢查。其中，血清學診斷方法仍為常規采用的方法，包括：瓊脂擴散試驗(AGID)、沉淀抑制試驗(CIEP)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、間接熒光抗體試驗(IFA)和病毒中和試驗(VNT)、RT-PCR-ELISA等。其中，VNT和ELISA兩種方法最為重要，在國際貿易中，前者為指定方法，后者為替代方法。

VNT雖是敏感特異的檢測方法，但也存在一些缺點，如(1)費時，一般10～12天才能獲得結果。(2)條件嚴格，涉及細胞培養和試驗樣品的無菌處理，結果判定要有經驗等，在發展中國家，尤其現地基層，沒有條件開展。(3)費力，工作量和勞動強度大，不適合大量樣品的檢測。ELISA目前建立有間接、競爭或阻斷ELISA等多種方法，檢測用抗原有全病毒抗原或針對核衣殼蛋白(N)、血凝素蛋白(H)的重組表達抗原，它們之間在敏感性和特異性上存在差異。由于羊血清往往存在背景值偏高的問題，因此，基于核衣殼蛋白(N)和血凝素蛋白(H)的單克隆抗體，建立了競爭或阻斷ELISA方法。目前英法兩國的小反芻獸疫參考實驗室雖有商品化的ELISA試劑盒面世，但仍存在敏感性和特異性不足的問題，尚不能取代黃金標準的VNT方法，加之使用價格比較昂貴。

發明內容

本發明人基于免疫組織化學原理，建立了基于免疫過氧化物酶細胞單層試驗(immunoperoxidase?monolayer?assay，IPMA)的小反芻獸疫病毒抗體檢測試劑盒，可以用于檢測病毒蛋白(細胞內抗原)相應的抗體，并且具有敏感特異、簡便快速、判讀直觀，適合大量樣品與溯源檢測的特點。本發明人建立的基于IPMA檢測小反芻獸疫病毒抗體的試劑盒和方法，為國內外首次報道；同時，所述試劑盒能夠取代國外價格昂貴的ELISA試劑盒，應用于我國對小反芻獸疫的防控實踐中。