[發(fā)明專利]一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510323449.6
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN104928377A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發(fā)明（設計）人: 趙薇薇;胡昌明;燕啟江;郭周萍
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發(fā)明屬于基因多態(tài)性檢測領域，具體涉及一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法與應用。

背景技術

肝臟是人體重要的解毒器官，許多藥物都經(jīng)肝臟代謝，細胞色素P450?(cytochrome?P450?)是主要的肝細胞Ⅰ相代謝酶之一。在CYP2C亞家族中，CYP2C19亞型對藥物反應起著關鍵性的作用，因為它們的活性存在顯著的個體差異，表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性，從而產(chǎn)生血藥濃度的個體差異。CYP2C19酶廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤等組織器官，主要在肝臟。其參與多種外源性物質代謝如：藥物、酒精、抗氧化劑、有機溶劑、染料、環(huán)境污染物質等。從理論上講，所有的藥物代謝酶都具有遺傳多態(tài)性。絕大多數(shù)藥物代謝酶的多態(tài)性是一種單基因多態(tài)性，是由于同一基因位點上具有多個等位基因引起的。遺傳學的改變使CYP450酶表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，并且具有明顯個體、種族或地域差異。

等位基因編碼的代謝酶具有不同的代謝能力：正常野生型表現(xiàn)為快代謝型(EM)；絕大多數(shù)突變型等位基因，因堿基的突變、插入或缺失而造成酶代謝能力降低，表現(xiàn)為慢代謝型(PM)，這對治療的個體反應和藥物毒副作用都產(chǎn)生重要影響。

CYP2C19至少存在14種突變基因和18種等位基因突變。編碼正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3……*17。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占東方人弱代謝表型(PM)的99％以上。*2，*3等位基因編碼的酶無活性，CYP2C19*2?等位基因變異的外顯子5第681位處的堿基發(fā)生變異(G/A)形成了一個異常剪接點，使得轉錄時在外顯子5的始端丟失了40個堿基對(643-682bp)，從而在翻譯時丟失了215-227位氨基酸，使215位氨基酸開頭的閱讀框架發(fā)生移動，因此在215位氨基酸下游第20個氨基酸處提前產(chǎn)生1個終止密碼，使蛋白合成過早被終止，結果使這一截短的含234個氨基酸的蛋白質喪失了催化活性。由此導致的慢代謝在中國人中的發(fā)生率約為30%。CYP2C19*3等位基因是在外顯子4第636位發(fā)生G/A突變，產(chǎn)生了提前的終止密碼，蛋白合成終止，使CYP2C19酶活性喪失。通過該酶代謝的藥物（如質子泵抑制劑，抗驚厥藥等）隨患者基因型不同，其療效和副作用也有明顯不同。

目前常用的對基因多態(tài)性位點檢測的方法有Sanger測序及AS-PCR+瓊脂糖凝膠電泳,Sanger測序的方法檢測基因多肽性位點成本相對較高，AS-PCR+瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測多態(tài)性位點靈敏性相對較低。因此需要開發(fā)一種成本相對較低，同時靈敏性好，準確度與精密度高的基因多態(tài)性位點檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于為了克服以上現(xiàn)有技術的不足而提供一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法與應用。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其包括如下步驟：首先提取血液基因組DNA，將其稀釋至100μg/mL后通過PCR擴增CYP2C19*3的序列，PCR擴增產(chǎn)物純化后將對應的序列進行SNaPshotPCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后通過毛細管電泳法檢測熒光信號并通過軟件分析SNP位點，通過不同的熒光檢測結果確定檢測?SNP?位點處堿基變化確定基因型。

作為本發(fā)明所優(yōu)選的一種實施方式，所述的檢測方法，具體包括如下步驟：

1）DNA提取：提取方法參照TIANampBloodDNAkit(購自Tiagen，貨號DP318)的說明書，提取完畢的DNA計算其濃度并稀釋至100μg/mL；

2）PCR擴增CYP2C19*3的序列：PCR反應體系中組分及體積份數(shù)分別為Q5^?Master?Mix12.5份，雙蒸水8.5份，，ward1份，Reverse1份；準確量取PCR反應體系23μL，向其中加入2μL稀釋后DNA模板；置PCR管放于PCR儀上并將反應程序設置如下：1：98℃，3?min；2：98℃，10?sec；3：58℃，30?sec；4：72℃，1?min；5：往復進行35個循環(huán)?；6：72℃，5?min；7：25℃?；

3）PCR擴增產(chǎn)物純化：取2體積份的ExoSAP-IT和3體積份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分裝到新的8連管中，每管加入PCR擴增產(chǎn)物2μL，混勻微離心，按以下程序進行反應：1：37℃,15?min?；2：80℃,15?min?3：4℃；