[發(fā)明專利]一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法與應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510323449.6
• 申請日: 2015-06-15
• 公開（公告）號: CN104928377A
• 公開（公告）日: 2015-09-23
• 發(fā)明（設計）人: 趙薇薇;胡昌明;燕啟江;郭周萍
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

1.一種CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其特征在于，首先提取血液基因組DNA，將其稀釋后通過PCR擴增CYP2C19*3的序列，PCR擴增產物純化后將對應的序列進行SNaPshotPCR擴增，擴增產物純化后通過毛細管電泳法檢測熒光信號并通過軟件分析SNP位點，通過不同的熒光檢測結果確定檢測?SNP?位點處堿基變化確定基因型。

2.根據(jù)權利要求1所述的CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：

1）DNA提取：提取方法參照TIANampBloodDNAkit(購自Tiagen，貨號DP318)的說明書，提取完畢的DNA計算其濃度并稀釋至100μg/mL；

2）PCR擴增CYP2C19*3的序列：PCR反應體系中組分及體積份數(shù)分別為Q5^?Master?Mix12.5份，雙蒸水8.5份，ward1份，Reverse1份；準確量取PCR反應體系23μL，向其中加入2μL稀釋后DNA模板；置PCR管放于PCR儀上并將反應程序設置如下：1：98℃，3?min；2：98℃，10?sec；3：58℃，30?sec；4：72℃，1?min；5：往復進行35個循環(huán)?；6：72℃，5?min；7：25℃?；

3）PCR擴增產物純化：取2體積份的ExoSAP-IT和3體積份的ddH2O混合配制酶混合物，按5μL分裝到新的8連管中，每管加入PCR擴增產物2μL，混勻微離心，按以下程序進行反應：1：37℃,15?min?；2：80℃,15?min?3：4℃；

4）SNaPshotPCR擴增：SNaPshotPCR反應體系中組分及體積份數(shù)分別為SnaPshot?ReadyMix?2.5份；5×sequencing?buffer?1份；Primers?Mixer???2份；ddH2O?3.5份；其中引物為SNE_CYP2C19*3；準確量取SNaPshotPCR反應體系9μL，向其中加入1μL步驟3）得到純化產物，混勻微離，按以下程序進行PCR1：96℃，10?sec；2：55℃，5?sec；3：60℃，30?sec；4：往復進行25?個循環(huán)；5：4℃?；

5）SNaPshotPCR產物純化：向SNaPshotPCR產物中加入1μLSAP酶，按以下程序進行反應：1：37℃，60?min?；2：75℃，15?min?；3：4℃；

6）SNaPshot分析：步驟5）獲得的產物經?ABI?3100-XL基因分析儀毛細管電泳法檢測熒光信號，通過GENEMAPPERIDV4.1軟件分析確定SNP位點，通過不同的熒光檢測結果確定檢測?SNP?位點處堿基變化確定基因型。

3.根據(jù)權利要求1所述的CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其特征在于，所述檢測方法的檢測位點為CYP2C19*3:?c.636G>A(p.Trp212Ter)(SNP:rs4986893)。

4.根據(jù)權利要求1所述的CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其特征在于，所述PCR中擴增CYP2C19*3的引物對如下：正向引物：GCTAGGCTGTAATTGTTAATTCGA；反向引物為：ACTTCAGGGCTTGGTCAATA。

5.根據(jù)權利要求1所述的CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其特征在于，SNaPshot中擴增CYP2C19*3的引物如下：GGATTGTAAGCACCCCCTG。

6.權利要求1所述的檢測方法在CYP2C19代謝相關藥物治療中的應用。