[發(fā)明專利]一種PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510320180.6
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN105506175A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧小紅;袁萬哲;張軍;余偉權(quán);李桃梅;李彬
• 申請（專利權(quán)）人: 鄧小紅
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種 PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測試劑盒。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一種以豬繁殖障礙和呼 吸道系統(tǒng)疾病為主要癥狀的傳染病。圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirusassociateddiseases，PCVAD)是由圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus2，PCV2)引起的一系列相關(guān)的臨床疾病，其中包括仔豬斷奶 后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome， PMWS)，豬皮炎與腎病綜合征(Porcinedermatitisandnephropathy syndrome，PDNS)和豬呼吸道疾病綜合征(Porcinerespiratorydisease syndrome，PRDS)等。其中PMWS最為嚴重，可引起斷奶仔豬漸進性 消瘦、呼吸困難、腹瀉、貧血等癥狀。豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR) 是由偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一種以發(fā)熱、奇癢、 急性腦脊髓炎等典型神經(jīng)癥狀并具有致死性的急性傳染病，感染豬后 可引起仔豬發(fā)病死亡，懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等癥狀。豬 瘟(Classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus， CSFV)引起的一種以急性出血和發(fā)熱為主要特征的傳染病。近年來， PRRS、PCVAD、PR和CSF已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病，給 我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

由于這幾種疾病在臨床上往往呈現(xiàn)相似的癥狀，又常常發(fā)生混合 感染，且根據(jù)臨床癥狀較難進行鑒別診斷，常規(guī)的血清學診斷方法又 存在操作復雜、費時費力費料、敏感性和特異性低等不足，與傳統(tǒng)方 法相比，PCR方法具有快速、敏感和易于操作的特點，被廣泛應用 于畜禽傳染病檢測和鑒別診斷中，有很多學者針對這四種病原建立了 該病原的PCR診斷方法，但是在感染多種病原時，不同的體系和程 序使得單重PCR方法操作步驟多且實際用量大。多重RT-PCR是在 常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進并發(fā)展起來的一種PCR擴增技術(shù)。其基本原理 是在一個反應體系中同時加入多對引物，如果存在與各對引物特異互 補的模板，在同一反應體系中可同時擴增出多條目的DNA片段。多 重RT-PCR既有單個PCR的特異性和敏感性，又較之快捷、經(jīng)濟， 一次PCR反應，可同時檢測多種病原。該方法可快速檢測鑒別多種 病原體，在臨床多種病原體混合感染的鑒別診斷上具有獨特優(yōu)勢和很 高的實用價值。為此，開展了多重PCR技術(shù)檢測這4種病的研究， 建立同時快速鑒別診斷這4種病毒的方法，并應用于臨床實踐中，以 期為這些疾病的防制和流行病學調(diào)查提供技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種豬繁殖與呼吸綜合 征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬瘟病毒多重PCR檢測 試劑盒及其檢驗方法，該試劑盒能夠快速、特異的檢測豬繁殖與呼吸 綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬瘟病毒。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測試劑盒， 包括反轉(zhuǎn)錄體系、2×NanoPCRMix和引物組合物，其中所述的引物 組合物為：

PRRSV的上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2；

CSFV的上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4；

PCV2的上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6；

PRV的上游引物SEQIDNO.7和下游引物SEQIDNO.8。

所述的反轉(zhuǎn)錄體系為5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMixture、反轉(zhuǎn)錄 酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn) 錄酶，所述的反轉(zhuǎn)錄引物為SEQIDNO.2和SEQIDNO.4。

所述的2×PCRMix由DNA聚合酶、2×PCRbuffer和dNTP Mixture組成。