[發明專利]一種PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201510320180.6
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN105506175A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 鄧小紅;袁萬哲;張軍;余偉權;李桃梅;李彬
• 申請（專利權）人: 鄧小紅
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

1.一種檢測PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR試劑盒， 其特征在于：包括反轉錄體系、2×NanoPCRMix和引物組合物，所 述的引物組合物為：

PRRSV的上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2；

CSFV的上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4；

PCV2的上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6；

PRV的上游引物SEQIDNO.7和下游引物SEQIDNO.8。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的反轉錄 體系為5×反轉錄緩沖液、dNTPMixture、反轉錄酶、RNA酶抑制劑 和反轉錄引物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述的反轉錄 酶為M-MLV反轉錄酶，所述的反轉錄引物為SEQIDNO.2。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的2×PCR Mix由DNA聚合酶、2×PCRbuffer和dNTPMixture組成。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒 還包括RNA提取試劑：TRIzolLSReagent、氯仿、異丙醇、75％乙 醇。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還 包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒和豬 瘟病毒陽性對照。

7.一種PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的多重PCR檢測方法， 其特征在于：

1)病毒RNA的提取；

2)反轉錄反應：所得的病毒總RNA11μL，加入2μL10μM 的反轉錄引物，4μL5×反轉錄緩沖液、0.5μL反轉錄酶、0.5μ LRNA酶抑制劑、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1～2h， 即得到cDNA溶液；

3)病毒DNA的提取

將200μL經過預處理的待測樣品用蛋白酶K消化1h，加入250ul 乙醇渦旋混勻，靜置5min，用洗液洗滌2次，12000r/min離心2min， 將沉淀自然風干后，溶于適量無核酸酶的水中貯存于-80℃備用；

4)多重PCR反應

反應體系為：10μL2×PCRMix、1μL上述cDNA溶液、1μ L上述DNA溶液，0.5μL10μM的上游引物、0.5μL10μM的下游 引物，最后加入無核酸酶水至總體積為20μL；

反應條件為：94℃3min，1個循環；94℃10s，55℃30s，72℃ 30s，共30個循環；72℃5min1個循環；

5)經1％瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增產物，進行判斷。

8.根據權利要求7所述的多重PCR檢測方法，其特征在于：所 述的判斷標準為：若出現321bp大小的條帶則待測樣品含有豬繁殖 與呼吸綜合征病毒；若出現440bp大小的條帶則待測樣品含有豬圓 環病毒2型；若出現359bp大小的條帶則待測樣品含有豬偽狂犬病 毒；若出現186bp大小的條帶則待測樣品含有豬瘟病毒。

9.權利要求1所述的引物組合物。

10.根據權利要求9所述的引物組合物，其特征在于：所述引物 組合物在檢測PRRSV、PCV2、PRV和CSFV中的應用。