[發明專利]一種分離純化大鼠真皮微血管內皮細胞的方法

在審

• 申請號: 201510319938.4
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN104877955A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 張濤;穆祥;董虹;胡格;楊重錦
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及哺乳動物細胞培養技術領域，具體地說，是大鼠真皮微血管內皮細胞的體外培養方法。

背景技術

微血管內皮細胞居于關鍵的解剖學位置，具有多種多樣的生物學功能，且在不同組織或器官中有顯著異質性，血小板內皮細胞黏附分子1（PECAM-1，即CD31）是其特異性表面分子。真皮是位于皮膚表皮和皮下組織之間的組織，其中含有豐富的微血管，是皮膚營養物質代謝交換的場所，真皮微血管內皮細胞功能障礙是皮膚炎癥、紅腫、出血等多種皮膚病變發生的關鍵環節，體外培養的大鼠真皮微血管內皮細胞是開展相關研究的常用模型。

微血管在各種組織器官中的分離困難，其內皮細胞難以像大血管內皮細胞一樣直接從血管壁消化獲得，且皮膚組織結構復雜，真皮層細胞種類多樣，高純度真皮微血管內皮細胞的體外培養不易成功。當前體外培養真皮微血管內皮細胞的報道多來源于人和小鼠，大鼠真皮微血管內皮細胞分離培養的研究較少。Murphy等報道，利用中性蛋白酶II溶液消化獲得大鼠耳部真皮組織，然后用手術刀背擠壓真皮組織使內皮細胞進入培養基，獲得大鼠真皮微血管內皮細胞[Murphy?HS,?等.?Endothelial?cell?determinants?of?susceptibility?to?neutrophil-mediated?killing.?Shock,?1999,?12(2):?111-117]；我國學者曹燕卿等利用中性蛋白酶II、膠原酶I型溶液依次消化，及Percoll溶液非連續密度梯度離心分離培養原代大鼠真皮微血管內皮細胞[曹燕卿，等，低溫暴露對真皮微血管內皮細胞功能的影響.?中國應用生理性雜志，2013,?29(4)：301-304]。中性蛋白酶消化分離表皮與真皮組織是常用的方法，但通過機械擠壓從真皮組織獲得內皮細胞的方法難以避免雜細胞的污染；密度梯度離心法對微血管內皮細胞的分離純化亦為非特異性方法，分離細胞的純度受分離液密度和離心等參數的影響顯著，且與操作人員的熟練程度有關，不易獲得高純度的目標細胞。

本發明采用中性蛋白酶II溶液消化分離大鼠真皮組織，用膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅱ混合溶液進一步消化獲得單細胞懸液，然后利用CD31免疫磁珠技術特異性分選，可獲得高純度的真皮微血管內皮細胞，該方法特異性強、可重復性強、易操作，能有效解決雜細胞的污染。

發明內容

本發明主要技術問題是解決現有微血管內皮細胞分離純化技術的不足，提供一種分離培養高純度大鼠真皮微血管內皮細胞的方法。

本發明所要解決的主要技術問題是通過如下技術方案來實現的：

取大乳鼠背部和腹部皮膚，用中性蛋白酶????????????????????????????????????????????????溶液消化分離真皮層，再用膠原酶型和型溶液消化獲得單細胞懸液，然后利用CD31免疫磁珠分選法獲得純化的目標細胞。

本發明一種分離純化大鼠真皮微血管內皮細胞的方法，其特征在于包括如下步驟：

A.?將免疫磁珠預洗，每25?μL免疫磁珠中加入0.5?μg?CD31單克隆抗體，于4oC旋轉搖床孵育過夜，清洗，獲得的CD31免疫磁珠重懸于等體積含0.1%?BSA的0.01M?PBS備用；所述的免疫磁珠預洗和孵育后清洗均用含有0.1%?牛血清白蛋白（BSA）的0.01?M?PBS，在KingFisher?96磁珠純化系統進行，程序設置為：慢速混合60?s，收集3次、每次2?s，中速釋放2?s，重復3次；

B.?將3日齡SD大鼠斷頸處死，75%乙醇擦拭消毒皮膚，剪取背部和腹部皮膚，放入4℃預冷Hank’s液，剪為約1cm×1cm皮片，浸入75%酒精約10?s，用含100?U/mL青霉素和100?μg/mL鏈霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附著的皮下組織；

C.?將所述皮片置于0.2%中性蛋白酶溶液中，于37℃旋轉搖床消化1?h，然后剝離并剔除表皮，將剩余的真皮組織放入含0.2%膠原酶Ⅰ和0.2%膠原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋轉搖床上消化1?h，消化液過100?μm孔徑細胞篩，濾液于1000?rpm離心8?min，棄上清，沉淀細胞團用含0.1%?牛血清白蛋白、2?mM?EDTA的0.01?M?PBS重懸至密度為1×10⁷個/mL的單細胞懸液；