[發(fā)明專利]一種分離純化大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510319938.4
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN104877955A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張濤;穆祥;董虹;胡格;楊重錦
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

微血管內(nèi)皮細胞居于關(guān)鍵的解剖學(xué)位置，具有多種多樣的生物學(xué)功能，且在不同組織或器官中有顯著異質(zhì)性，血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（PECAM-1，即CD31）是其特異性表面分子。真皮是位于皮膚表皮和皮下組織之間的組織，其中含有豐富的微血管，是皮膚營養(yǎng)物質(zhì)代謝交換的場所，真皮微血管內(nèi)皮細胞功能障礙是皮膚炎癥、紅腫、出血等多種皮膚病變發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，體外培養(yǎng)的大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞是開展相關(guān)研究的常用模型。

微血管在各種組織器官中的分離困難，其內(nèi)皮細胞難以像大血管內(nèi)皮細胞一樣直接從血管壁消化獲得，且皮膚組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，真皮層細胞種類多樣，高純度真皮微血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)不易成功。當(dāng)前體外培養(yǎng)真皮微血管內(nèi)皮細胞的報道多來源于人和小鼠，大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的研究較少。Murphy等報道，利用中性蛋白酶II溶液消化獲得大鼠耳部真皮組織，然后用手術(shù)刀背擠壓真皮組織使內(nèi)皮細胞進入培養(yǎng)基，獲得大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞[Murphy?HS,?等.?Endothelial?cell?determinants?of?susceptibility?to?neutrophil-mediated?killing.?Shock,?1999,?12(2):?111-117]；我國學(xué)者曹燕卿等利用中性蛋白酶II、膠原酶I型溶液依次消化，及Percoll溶液非連續(xù)密度梯度離心分離培養(yǎng)原代大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞[曹燕卿，等，低溫暴露對真皮微血管內(nèi)皮細胞功能的影響.?中國應(yīng)用生理性雜志，2013,?29(4)：301-304]。中性蛋白酶消化分離表皮與真皮組織是常用的方法，但通過機械擠壓從真皮組織獲得內(nèi)皮細胞的方法難以避免雜細胞的污染；密度梯度離心法對微血管內(nèi)皮細胞的分離純化亦為非特異性方法，分離細胞的純度受分離液密度和離心等參數(shù)的影響顯著，且與操作人員的熟練程度有關(guān)，不易獲得高純度的目標(biāo)細胞。

本發(fā)明采用中性蛋白酶II溶液消化分離大鼠真皮組織，用膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅱ混合溶液進一步消化獲得單細胞懸液，然后利用CD31免疫磁珠技術(shù)特異性分選，可獲得高純度的真皮微血管內(nèi)皮細胞，該方法特異性強、可重復(fù)性強、易操作，能有效解決雜細胞的污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要技術(shù)問題是解決現(xiàn)有微血管內(nèi)皮細胞分離純化技術(shù)的不足，提供一種分離培養(yǎng)高純度大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的方法。

本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

取大乳鼠背部和腹部皮膚，用中性蛋白酶????????????????????????????????????????????????溶液消化分離真皮層，再用膠原酶型和型溶液消化獲得單細胞懸液，然后利用CD31免疫磁珠分選法獲得純化的目標(biāo)細胞。

本發(fā)明一種分離純化大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的方法，其特征在于包括如下步驟：

A.?將免疫磁珠預(yù)洗，每25?μL免疫磁珠中加入0.5?μg?CD31單克隆抗體，于4oC旋轉(zhuǎn)搖床孵育過夜，清洗，獲得的CD31免疫磁珠重懸于等體積含0.1%?BSA的0.01M?PBS備用；所述的免疫磁珠預(yù)洗和孵育后清洗均用含有0.1%?牛血清白蛋白（BSA）的0.01?M?PBS，在KingFisher?96磁珠純化系統(tǒng)進行，程序設(shè)置為：慢速混合60?s，收集3次、每次2?s，中速釋放2?s，重復(fù)3次；

B.?將3日齡SD大鼠斷頸處死，75%乙醇擦拭消毒皮膚，剪取背部和腹部皮膚，放入4℃預(yù)冷Hank’s液，剪為約1cm×1cm皮片，浸入75%酒精約10?s，用含100?U/mL青霉素和100?μg/mL鏈霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附著的皮下組織；

C.?將所述皮片置于0.2%中性蛋白酶溶液中，于37℃旋轉(zhuǎn)搖床消化1?h，然后剝離并剔除表皮，將剩余的真皮組織放入含0.2%膠原酶Ⅰ和0.2%膠原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋轉(zhuǎn)搖床上消化1?h，消化液過100?μm孔徑細胞篩，濾液于1000?rpm離心8?min，棄上清，沉淀細胞團用含0.1%?牛血清白蛋白、2?mM?EDTA的0.01?M?PBS重懸至密度為1×10⁷個/mL的單細胞懸液；