[發明專利]一種分離純化大鼠真皮微血管內皮細胞的方法

在審

• 申請號: 201510319938.4
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN104877955A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發明（設計）人: 張濤;穆祥;董虹;胡格;楊重錦
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從大鼠真皮組織中分離、純化微血管內皮細胞的方法，其特征在于：所述的方法主要涉及大鼠真皮組織的單細胞懸液制備和目的細胞的CD31免疫磁珠法分選，與傳統真皮微血管內皮細胞分離純化方法比較具有純度高、可重復性強的特點。

2.根據權利要求1所述的一種從大鼠真皮組織中分離、純化微血管內皮細胞的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

A.?將免疫磁珠預洗，每25?μL免疫磁珠中加入0.5?μg?CD31單克隆抗體，于4oC旋轉搖床孵育過夜，清洗，獲得的CD31免疫磁珠重懸于等體積含0.1%?BSA的0.01M?PBS備用；所述的免疫磁珠預洗和孵育后清洗均用含有0.1%?牛血清白蛋白（BSA）的0.01?M?PBS，在KingFisher?96磁珠純化系統進行，程序設置為：慢速混合60?s，收集3次、每次2?s，中速釋放2?s，重復3次；

B.?將3日齡SD大鼠斷頸處死，75%乙醇擦拭消毒皮膚，剪取背部和腹部皮膚，放入4℃預冷Hank’s液，剪為約1cm×1cm皮片，浸入75%酒精約10?s，用含100?U/mL青霉素和100?μg/mL鏈霉素的Hank’s液漂洗5遍，剔除皮片上附著的皮下組織；

C.?將所述皮片置于0.2%中性蛋白酶???????????????????????????????????????????????溶液中，于37℃旋轉搖床消化1?h，然后剝離并剔除表皮，將剩余的真皮組織放入含0.2%膠原酶Ⅰ和0.2%膠原酶Ⅱ的溶液中充分剪碎，于37℃旋轉搖床上消化1?h，消化液過100?μm孔徑細胞篩，濾液于1000?rpm離心8?min，棄上清，沉淀細胞團用含0.1%?牛血清白蛋白、2?mM?EDTA的0.01?M?PBS重懸至密度為1×10⁷個/mL的單細胞懸液；

D.?將所述每毫升單細胞懸液中加25?μL?CD31免疫磁珠，于15~20oC旋轉搖床孵育30~60?min，分選目的細胞-CD31免疫磁珠復合物于0.2?mL含5%胎牛血清、1?mM氯化鈣和4?mM氯化鎂的DMEM培養基；所述的目的細胞-CD31免疫磁珠復合物的分選使用KingFisher?96磁珠純化系統，程序設置為：慢速混合30?s，收集2次，每次5?s，重復4次；

E.?將所述的每0.2?mL目的細胞-CD31免疫磁珠復合物懸液加入4?μL?DNase?溶液，室溫孵育15?min，釋放并除去目的細胞上的CD31免疫磁珠；所述目的細胞上CD31免疫磁珠的除去使用KingFisher?96磁珠純化系統，程序設置為：中速混合1?min，收集2次、每次1?s，中速釋放3?s；重復1次；所述的目的細胞懸液于1000?rpm離心8?min，沉淀目的細胞團用DMEM完全培養基（含20%胎牛血清、2?mM?L-谷氨酰胺、100?IU青霉素和100?μg/mL鏈霉素）重懸，調整密度為1×10⁵個/mL接種培養，每3天更換一次完全培養基；

F.?將所述獲得的目的細胞即大鼠真皮微血管內皮細胞孵育培養至亞匯合狀態，用含0.05%胰蛋白酶和0.005%?EDTA的0.01?M?PBS溶液消化脫壁，用DMEM完全培養基重懸，調整密度為1×10⁵個/mL，進行傳代培養。