[發明專利]高速逆流色譜分離純化十大功勞葉中單體化合物的方法

有效

• 申請號: 201510316229.0
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN104892687B
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 胡衛成;王新風;沈婷;吳磊
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C07H1/08
• 分類號: C07H1/08;C07H17/07;C07C69/732;C07C67/48
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司32206
• 代理人: 杜靜

技術領域

本發明屬于天然藥物化學領域，具體涉及一種從苦丁茶十大功勞葉中快速分離純化綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法。

背景技術

十大功勞葉系小聚科植物闊葉十大功勞(Mahonia bealei (Fort.) Carr.)的干燥葉，具有清熱解毒、消炎止痛、燥濕瀉火、清肝明目之功效。在秦嶺以南各省還被廣泛應用為苦丁茶。民間廣泛用其作為主治頭暈耳鳴、腰膝酸軟、濕熱瀉痢、胃火牙痛、黃疸性肝炎等疾病。現代藥理研究發現十大功勞具有抑菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗增殖及降血壓等活性，是一種有開發價值的藥用植物。

對十大功勞化學成分的研究多集中在其生物堿上，現未有文獻報道從十大功勞葉中分離出綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷化合物，現有文獻報道從其它中草藥中分離純化綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷等的方法常采用柱層析方法。柴興云等[山銀花中酚酸類成分研究，中國天然藥物，2004年第6期]用95 %, 90 %,85 %, 70 %乙醇回流，乙酸乙酯萃取及硅膠柱，SephadexLH –20柱純化分離的方法分離純化，根據化合物的理化特征和光譜數據鑒定其結構，從山銀花中分離到綠原酸等化合物。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷為分布在大部分高等植物植物中，萬春鵬[東方肉穗草黃酮類化學成分研究，中國中藥雜志, 2009年第2期 ]以70% 乙醇室溫提取，醋酸乙酯溶劑萃取和大孔吸附樹脂、SephadexLH-20，ODS及正相硅膠柱等色譜手段進行分離，分離出槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。趙小亮等 [荷葉化學成分研究，中國中藥雜志，2013年第5期 ]利用硅膠柱、大孔吸附樹脂柱、Sephadex LH-20柱和制備薄層色譜法等分離手段，經理化常數和光譜分析從荷葉正丁醇部分中分離得到異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

這些成分通常采用反復的柱層析，操作復雜，耗時長，溶劑消耗量大，而且樣品損失大，重復效果不夠理想。

高速逆流色譜（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）是Ito等發明的一種新型的、連續高效的液 - 液分配色譜，是建立在一種特殊的動力學平衡現象——單向性流體動力平衡（HDES）體系之上的一種分離方法。與常規固-液色譜分離方法相比較，由于采用液體作為固定相載體，目標化合物在互不相容的兩相由于分配系數的不同而得以分離，解決了傳統固體載體樣品死吸附、變性、峰形拖尾等問題，用高速逆流色譜法不僅使分離速度大為提高，且根據紫外吸收色譜圖可良好重復收集樣品，具有制備效率高、制備量大、費用低等優點，因而近年來日益受到人們的關注，已經廣泛應用于生物醫藥、天然產物、環境分析、食品和化妝品等領域，特別在天然產物行業中已被認為是一種有效的新型分離技術。

發明內容

本發明的目的在于：克服現有技術的不足，提供一種操作簡便、綜合成本低、分離量大、產品純度高、樣品損失小的高效快速從十大功勞葉中分離純化綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法。

本發明的技術解決方案是：從十大功勞葉中分離純化綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法包括以下工藝步驟：

(1) 十大功勞葉提取物的制備：十大功勞葉陰干、粉碎，純乙醇為溶劑超聲提取，固液比為 1 ：20 ，提取時間 2 h，過濾，濾渣重復處理 2 次；合并濾液并真空減壓濃縮得十大功勞葉粗提物；

(2) 將步驟1中粗提物用水打散，分別用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液過濾，減壓濃縮分別得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰箱保存備用；

(3) 單體的分離：采用正己烷 - 甲醇–乙酸乙酯水為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，分離柱轉速為700 - 900 rpm，對十大功勞葉乙酸乙酯萃取段進行 HSCCC 分離，紫外檢測器在線監測，分別收集不同餾分并減壓干燥，得綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

步驟（3）所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的體積比為1:1:1:1-1:8:1:8，優選1:5:1:5。

步驟（3）所述的流動相流速為2 mL/min。