[發明專利]納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌

有效

• 申請號: 201510315842.0
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105116146B
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 張紅星;齊穎穎;段慧霞;謝遠紅;劉慧;張帥
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12
• 代理公司: 北京市合德專利事務所11244
• 代理人: 王文會,劉榜美

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體公開了一種納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，適用于食品中致病菌單增李斯特菌的檢測。

背景技術

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes ,簡稱為單增李斯特菌），是一種人畜共患病致病菌，也是常見的食源性致病菌之一，廣泛存在于肉、蛋、海產品、乳制品、蔬菜等食物中，該菌在4℃仍可生長，多次發生單增李斯特菌污染中毒的事件，它能引起腦膜炎、腸胃炎癥、敗血病、流產等臨床癥狀，尤其對新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下人群的危害很大，有很高的致死率，成為食品安全的一大隱患。

目前，檢測單核增生李斯特氏菌的方法有三種：傳統的生物學分離培養法、分子生物學檢測法、免疫檢測法。其中傳統培養法即國標方法耗時耗力，分子檢測方法價格昂貴，免疫檢測法一般靈敏度達不到要求，均不適合現場大量樣品的快速篩查。

本研究主要利用多種免疫檢測法相結合來檢測食品中單核增生李斯特氏菌，這種新型的快速檢測方法結合了納米免疫磁珠分離技術和膠體金層析技術，其方法具有快速、靈敏度高，準確率高，低成本、高通量、便攜帶等優點，為致病菌檢測指出了新的方向。

發明內容

本發明主要針對現有的生物檢測方法費時費力、操作過程復雜以及靈敏度不高的缺陷，而提供一種以納米免疫磁珠分離技術聯合膠體金免疫層析快速檢測單增李斯特菌試紙條制備的方法。從而實現簡便、快速、準確的檢測單增李斯特菌的目的。

本發明提出的納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌方法，其特征在于：應用鏈霉親和素-生物素介導偶聯的納米磁珠標記經雜交瘤技術制備篩選所得的單增李斯特菌特異性反應鼠系單抗制備成免疫磁珠；同時以膠體金標記的另一抗單增李斯特菌的配對單克隆抗體為標記抗體，選自新西蘭大白兔的抗單增李斯特菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG二抗分別作為檢測線T區和質控線C區，經過膠體金標記抗體的結合墊、檢測線T區和質控線C區的層析膜、吸水墊組建成一種基于雙抗體夾心檢測原理的單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條。檢測樣品時，將免疫磁珠與樣品中的菌體進行特異性的捕獲進富集，再在膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上加入其富集液體，依據膠體金的顏色在檢測線T區域和質控線C區域處形成肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現單增李斯特菌的快速半定量檢測。

其中所述的抗單增李斯特菌特異性兩株單抗是采用雜交瘤技術制備篩選所得，并且經雙抗體夾心ELISA篩選出的配對抗體，所述的抗單增李斯特菌特異性多抗是通過免疫新西蘭大白兔制備所得，兩種抗體具有很高的特異性。

本發明所述的納米免疫磁珠的制備步驟如下：

1、抗體的制備與純化：

以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫8周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規的雜交瘤技術和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細胞株，進而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養，注射到小鼠體內制備腹水，所得腹水經辛酸-硫酸銨沉淀法進行抗體純化；

以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫新西蘭大白兔，所得抗單增李斯特菌血清經硫酸銨沉淀法進行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用；

2、納米磁珠與抗體的偶聯：

將180nm磁珠洗滌，采用活潑酯的方法，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）、二氯乙烷（EDC），置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態，37℃活化2h，將活化磁珠與鏈霉親和素偶聯，獲得的鏈霉親和素磁珠；再將其與生物素化的單增李斯特菌單克隆抗體1B12，置于混勻儀上偶聯，制成鏈霉親和素免疫磁珠并于4℃冰箱保存備用。

本發明所述的膠體金試紙條制備步驟如下：

1、膠體金的制備：取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于燒杯內，加熱煮沸時加入2mL 1%檸檬酸三鈉，繼續加熱煮沸5min, 冷卻后加超純水至100mL，制得40nm的膠體金溶液；

2、結合墊的處理：將制備出的另一株與磁珠偶聯單抗1B12配對的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10標記于膠體金顆粒上，使其終濃度為25μg/mL，使之標記液體噴點在結合墊上以備用；

3、層析膜的包被： 用自動噴膜儀，以 0.9μL/cm的速度，將特定濃度的抗血清、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0.8cm，包被后的層析膜于 37℃ 干燥箱中烘干8小時，置于干燥器中保存備用；