[發明專利]納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌

有效

• 申請號: 201510315842.0
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105116146B
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 張紅星;齊穎穎;段慧霞;謝遠紅;劉慧;張帥
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12
• 代理公司: 北京市合德專利事務所11244
• 代理人: 王文會,劉榜美

1.一組在檢測中配對使用的抗體，由保藏編號為CGMCC No.10312的雜交瘤細胞分泌的抗單增李斯特菌單克隆抗體1B12和由保藏編號為CGMCC No.10311的雜交瘤細胞分泌的抗單增李斯特菌單克隆抗體3B10 組成，所述雜交瘤細胞保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏日期為2015年1月15日。

2.一種納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于：應用鏈霉親和素-生物素介導偶聯的納米磁珠標記經雜交瘤技術制備篩選所得的單增李斯特菌特異性反應鼠系單抗制備成納米免疫磁珠；同時以膠體金標記的另一抗單增李斯特菌的配對單克隆抗體為標記抗體，選擇新西蘭大白兔免疫的抗單增李斯特菌多克隆抗體和山羊抗小鼠IgG二抗分別作為檢測線T區和質控線C區的包被抗體，經過膠體金標記抗體的結合墊、檢測線T區和質控線C區的層析膜、吸水墊組建成一種基于雙抗體夾心檢測原理的單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條；檢測樣品時，將納米免疫磁珠與樣品中的菌體進行特異性的捕獲并富集，再在膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上加入富集液體，依據膠體金的顏色在檢測線T區域和質控線C區域處形成肉眼可見的顯色條帶的判讀，從而實現單增李斯特菌的快速定性檢測；

所述的膠體金試紙條制備方法如下：

（1）膠體金的制備：取0.01%HAuCl₄水溶液100mL置于燒杯內，加熱煮沸時加入2mL 1%檸檬酸三鈉，繼續加熱煮沸5min, 冷卻后加超純水至100mL，制得40nm的膠體金溶液；

（2）結合墊的處理：將制備出的另一株與磁珠偶聯抗單增李斯特菌單克隆抗體1B12 CGMCC No.10312配對的抗單增李斯特菌的單克隆抗體3B10 CGMCC No.10311標記于膠體金顆粒上，使其終濃度為25μg/mL，使標記液體噴點在結合墊上以備用；

（3）層析膜的包被：用自動噴膜儀，以 0.9μL/cm的速度，將特定濃度的抗單增李斯特菌多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG分別噴點在層析膜的T線和C線處，噴點時線與線間的間隔距離為0.8cm;包被后的層析膜于37℃的干燥箱中烘干8小時，置于干燥器中保存備用；

（4）試紙條的組裝與制備：將樣品墊、結合墊、層析膜、吸水墊依次相互交錯約1mm粘貼在襯板上，然后在上層覆蓋密封膜;根據要求寬度切割即可得到膠體金免疫層析試紙條。

3.根據權利要求2所述的納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，所述的納米免疫磁珠的制備方法如下：

（1）抗體的制備與純化：以高壓滅菌處理單增李斯特菌體作為抗原免疫BALB/c雌性小鼠，按常規的雜交瘤技術和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細胞株，進而將抗單增李斯特菌的特異性抗體細胞株增殖培養，注射到小鼠體內制備腹水，所得腹水經辛酸-硫酸銨沉淀法進行抗體純化；

（2）納米免疫磁珠與抗體的偶聯：采用活潑酯的方法，將180nm磁珠與鏈霉親和素偶聯獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成納米免疫磁珠，具體步驟如下：洗滌磁珠，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺、EDC，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態，37℃活化2h；將活化的磁珠與鏈霉親和素偶聯，獲得鏈霉親和素磁珠，再將其與生物素化的單增李斯特菌單克隆抗體1B12 CGMCC No.10312，置于混勻儀上偶聯，形成納米免疫磁珠，并于4℃冰箱保存備用。

4.根據權利要求2所述的納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，所述的納米免疫磁珠捕獲富集菌體方法如下：取樣品與自制的納米免疫磁珠在旋轉混合儀上室溫反應，反應后進入磁場分離，經重懸、水浴即可得到菌體富集液用于下一步膠體金試紙條的檢測。

5.根據權利要求4所述的納米免疫磁珠技術聯合膠體金層析快速檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，將待測樣品富集液滴入檢測卡加樣孔，待5~15分鐘后讀取T、C線的顯色，得到結果。