[發明專利]采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞的方法及應用

在審

• 申請號: 201510313877.0
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105219698A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: 趙振民;張辰;張翔宇;呂璘;韓婷璐;童海州;劉磊;杜水果
• 申請（專利權）人: 趙振民
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于組織工程產品制備技術領域，具體涉及一種采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法及應用。

背景技術

肝移植是治療晚期肝病的有效方法之一，但缺乏供體來源、手術費用昂貴及術后終生使用免疫抑制劑等諸多問題制約了該項技術的臨床應用。因此，干細胞通過培養、誘導、分化為肝細胞樣細胞用于細胞移植、或作為生物工程化的類肝器官的種子細胞，為肝病的治療提供了新的治療方法與技術，也為藥物代謝與毒性試驗提供了新的方法與技術。然而，供區短缺、采集困難等嚴重限制了細胞的獲取，對于供區細胞的儲存和活性維持的適當的細胞培養方案的缺乏等對該項技術的應用也構成了明顯的障礙。

利用取自人自體小涎腺的上皮干/祖細胞，在體外培養誘導分化為肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞，具有來源廣泛、取材方便、創傷微小、供區隱蔽等優點，該干細胞生長特性好，可以在體外長期大量擴增，可以滿足臨床上細胞使用量多的需要。除可用于體內移植治療肝病外，還可作為體外生物工程化的類肝器官的構建、體外肝病模型的構建，藥物試驗、毒性試驗與肝臟功能研究等。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法及應用。

一種采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，按照如下步驟進行：

(1)制備人小涎腺上皮干/祖細胞：

a)預處理人小涎腺組織；

b)在角質細胞培養基中貼壁培養預處理后的人小涎腺組織，培養分離出小涎腺上皮干/祖細胞。

角質細胞培養基：DMEM/F12添加BSA(牛血清白蛋白)5μg/mL，transferrin(轉鐵蛋白)5μg/mL，BPE(牛垂體提取物)50μg/mL，insulin(胰島素)3.75g/mL，FGF-23ng/mL，EGF1ng/mL，epinephrine(腎上腺素)500ng/mL，hydrocortisone(氫化可的松)0.5g/mL，ProstaglandinE2(前列腺素E2)10^-8MandT330nM，100U/ml青/鏈霉素。

C)小涎腺上皮干/祖細胞在上皮細胞培養基中進一培養擴增。

上皮細胞培養基：在角質細胞培養基中添加了3μMCHIR、0.5μMA83、為了預防細胞凋亡，在每次傳代后第12或24小時內添加0.5μMThiazovivin。

(2)人小涎腺上皮干/祖細胞誘導分化為肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞，接種人小涎腺上皮干/祖細胞于平面培養體系或3D培養體系中，添加含有生長因子的上皮干細胞成肝誘導培養基，每三天換液，經過21天誘導培養后獲得肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞。

成肝細胞誘導培養基，在角質細胞培養基中中添加有：20ngml^-1OSM，0.5mMA83，0.1mMC-E，20ng/ml的HGF，10ng/ml的IGF，100nM的地塞米松，10mmol/L的尼克酰胺。

所述上皮干細胞成肝誘導培養基中還可以加入100mmol/L的蘋果酸，加入后，可縮短誘導時間。

所述預處理人小涎腺組織的步驟為：

將小涎腺組織轉移到培養皿中，用小剪刀去除多余的結締組織，分離得到完整的小涎腺，吸去培養皿中的全部液體，用眼科剪將其剪成大約1mm³的碎塊。

所述預處理切取小涎腺組織的過程中，將組織轉移到培養皿中后，還可以向培養皿中加入小薊提取物培養液，浸泡10min，用小剪刀去除多余的結締組織，分離得到完整的小涎腺，吸去培養皿中的全部液體，用眼科剪將其剪成大約1mm³的碎塊。這樣處理后的小涎腺組織在后續貼壁培養過程中，能縮短培養時間。

所述的小薊提取物培養液采用如下方法制備：將小薊曬干，磨成粉末，過200篩，然后加5倍重量的70％乙醇溶液回流提取3次，合并濾液，活性炭脫色，蒸干，得到白色粉末狀物質，采用去離子水配置成質量分數1％的溶液，制成小薊提取物培養液。

所述貼壁培養預處理后的人小涎腺組織的步驟為：

用小鑷子將人小涎腺組織碎塊均勻的鋪于培養瓶底部，間距平均5mm，加好培養基后豎立放于培養箱中，添加5ml角質細胞培養基，6至8小時后放倒培養瓶，使組織塊完全浸在培養液中，三天后首次觀察，棄去未貼壁的組織塊和液體，重新加入5ml角質細胞培養基，以后每3天換液一次。