[發明專利]采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞的方法及應用

在審

• 申請號: 201510313877.0
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105219698A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: 趙振民;張辰;張翔宇;呂璘;韓婷璐;童海州;劉磊;杜水果
• 申請（專利權）人: 趙振民
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，其特征在于，按照如下步驟進行：

(1)制備人小涎腺上皮干/祖細胞：

a)預處理人小涎腺組織；

b)在角質細胞培養基中貼壁培養預處理后的人小涎腺組織，培養分離出小涎腺上皮干/祖細胞；

小涎腺上皮于/祖細胞在上皮細胞培養基中進一培養擴增；

(2)人小涎腺上皮干/祖細胞誘導分化為肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞，接種人小涎腺上皮干/祖細胞于平面培養體系或3D培養體系中，添加含有生長因子的上皮干/祖細胞成肝誘導培養基，經過21天誘導培養后獲得肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞。

2.根據權利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，其特征在于，所述預處理人小涎腺組織的步驟為：

將小涎腺組織轉移到培養皿中，用小剪刀去除多余的結締組織，分離得到完整的小涎腺，吸去培養皿中的全部液體，用眼科剪將其剪成大約1mm³的碎塊。

3.根據權利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，其特征在于，所述貼壁培養預處理后的人小涎腺組織的步驟為：

用小鑷子將人小涎腺組織碎塊均勻的鋪于培養瓶底部，間距平均5mm，加好培養基后豎立放于培養箱中，添加5ml角質細胞培養基，6至8小時后放倒培養瓶，使組織塊完全浸在培養液中，每3天更換培養基，7天后，人小涎腺組織長出鵝卵石狀或鋪路石狀的原代細胞。

4.根據權利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，其特征在于，所述小涎腺上皮干/祖細胞進一步培養和擴增的步驟為：

當細胞達到70-80％融合時，進行傳代，吸走培養瓶中原有培養基，用1×PBS洗滌細胞2次，吸去PBS，加入0.25％胰酶，旋轉，使胰酶均勻覆蓋培養器皿表面，37℃消化3分鐘，顯微鏡下可見上皮干/祖細胞細胞間隙增大，細胞形態變圓，此時加入含10％FBS完全培養基終止消化，再次用吸管吸取液體，輕輕反復3-5次吹打培養器皿表面，使上皮干/祖細胞徹底脫離瓶皿底壁，將細胞移入離心管中，再向培養瓶中加入1×PBS洗1-2次，并將洗液一并轉移至離心管中，244g離心5分鐘，吸去上清液，棄去上清，加入5mL上皮細胞培養基重懸細胞沉淀，用吸管輕輕吹打收集的細胞懸液，取樣計數，接種細胞懸液于培養皿中，之后細胞每3天更換上皮細胞培養基，第一次按1∶1傳代，之后按1∶3或1∶4傳代。

5.根據權利要求1所述采用人小涎腺上皮干/祖細胞制備肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的方法，其特征在于，所述小涎腺上皮干/祖細胞誘導分化為肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的步驟為：

小涎腺干/祖細胞在平面培養系統中培養擴增，當細胞增殖到85％融合時，可接種至Matrigel3D培養體系中用于成肝誘導，Matrigel3D培養體系制備方式為將充分溶解后的Matrigel與上皮細胞培養基以2比1比例混合均勻，每孔350ul添加至24孔細胞培養板中，鋪平，置入37℃細胞培養箱中，約30分鐘后，Matrigel凝固為凝膠狀，可接種細胞使用，胰酶法消化平面培養系統中小涎腺干/祖細胞至單細胞懸液并計數，接種至Matrigel3D培養體系中，比例為每孔15000個細胞，并加入500μL上皮細胞培養基，待細胞培養1天后換液，每孔加入500μL成肝細胞誘導培養基，隨后每三天換液，誘導培養21天左右后，小涎腺干/祖細胞轉變成肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞。