[發明專利]一種誘導西洋參愈傷組織的方法

在審

• 申請號: 201510313664.8
• 申請日: 2015-06-08
• 公開（公告）號: CN104885949A
• 公開（公告）日: 2015-09-09
• 發明（設計）人: 丁之恩;孫雨薇;丁昱;任琪;徐浩;袁艷
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 王凝;張波

技術領域

本發明屬于天然產物領域，具體地說涉及西洋參不同外植體愈傷組織的誘導方法。

背景技術

西洋參(Panax?quinquefolium)系五加科人參屬多年生草本植物，生長于北美原始森林中的古老植物，具有“活化石”之稱，是一種名貴藥材，藥用和經濟價值高。我國自20世紀80年代大面積引種西洋參成功以來，已發展成為繼美國、加拿大后世界第三大西洋參生產國和世界第一大消費國。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經，以補益為主，可滋陰降火、益氣生津。服用方法分為煮、燉、蒸食、切片含化、研成細粉沖服等。西洋參中含有皂甙、多糖、黃酮類、揮發油、微量元素等豐富的生理活性物質，對人體具有補益作用，在免疫調節、抗癌、抗衰老等方面有獨特效果，因此常用于保健品或“補品”而受到青睞。

無論野生或人工栽培的西洋參，因自身生理特性，生長緩慢，大多在4至6年才能收獲入藥(主要藥效成分是“西洋參皂甙”)，且西洋參種子資源稀少，價格昂貴。因此，開展西洋參細胞培養技術，工廠化方法生產人參皂甙，具有十分巨大的意義和市場前景。西洋參細胞培養是指在無菌條件下，將離體的西洋參器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織、細胞、胚胎、原生質體等外植體，在人工控制的培養基上，給予適宜的環境條件，誘導產生愈傷組織或潛伏芽，或長成完整的植株。本發明主要側重于誘導西洋參不同外植體(葉片、莖段、主根、須根、種胚)，獲得疏松、活躍的愈傷組織，為西洋參細胞培養、實現工廠化生產生理活性物質——皂甙提供前期材料準備和理論依據，對實際應用具有指導意義。

發明內容

本發明提供一種誘導西洋參愈傷組織的方法，包含原料消毒步驟和愈傷組織誘導培養步驟，其中消毒是用0.1-0.3％HgCl₂與75％酒精組合進行消毒，其中愈傷組織誘導培養是將消毒后的原料接種于誘導培養基上，進行誘導培養。

西洋參不同外植體的消毒條件與消毒效果有直接關系，控制0.1％HgCl₂與75％酒精處理的消毒時間。本方法中通過控制不同外植體的不同的消毒時間，確保外植體的存活率及降低污染率，為愈傷組織的誘導提供條件。

在本發明的一個具體的實施方式中，其中所述的原料為葉片、莖、主根、須根、種胚。

本發明中原料獲得與選擇：(1)在西洋參種植地取2年生西洋參完整植株，保持材料的低溫、新鮮帶回實驗室，部分植株立即進行預處理，另一部分植株移植在花盆中，置于樹蔭下，保持濕潤和新鮮，使其正常生長，作為外植體采集源；(2)取經過后熟處理，并且已經“開口的西洋參種子”，取回實驗室，5℃冷藏。使用時除去種皮，取出飽滿籽粒，用清水反復清洗，并將部分種子接種于帶有濕潤紗布的培養皿中，每皿20—30顆，恒溫(23—28℃)條件下暗箱培養，以獲得“新鮮、無菌西洋參苗”，另一部分種子經升汞、酒精消毒后清水沖洗，接種于MS培養基，以獲得“無菌苗”。

在本發明另一個具體實施方式中，所述的誘導西洋參愈傷組織的方法，其中誘導培養基為MS+2.5-3.5mg/L2,4-D+0.5-0.8mg/L?6-BA或者MS+2.0-3.0mg/L?2,4-D+6.0-9.0mg/L?GA₃或者MS+2.0-3.0mg/L2,4-D+3.0-4.5mg/LGA₃。

在本發明另一個具體實施方式中，所述的誘導西洋參愈傷組織的方法，其中，對于葉片、莖段、主根、須根，誘導培養基為MS+2.5-3.5mg/L?2,4-D+0.5-0.8mg/L?6-BA；對于種胚，誘導培養基為MS+2.0-3.0mg/L?2,4-D+6.0-9.0mg/L?GA₃；對于西洋參無菌苗培養為，MS+2.0-3.0mg/L2,4-D+3.0-4.5mg/LGA₃；其中，西洋參無菌苗為西洋參種仁經升汞、酒精消毒后接種于MS培養基，獲得的無菌苗。

本發明培養基激素水平的確定：通過L₁₆(4⁵)正交試驗確定2,4-D、KT、6-BA、NAA、IBA五種常用激素對西洋參不同外植體(葉片、莖段、主根、須根)誘導愈傷組織的影響，通過控制2,4-D與GA₃濃度，確定西洋參種胚所需的誘導激素配方。