[發明專利]油茶胚根不定芽誘導獲得再生植株的方法

有效

• 申請號: 201510310417.2
• 申請日: 2015-06-08
• 公開（公告）號: CN104823861A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發明（設計）人: 譚曉風;李澤;盧錕;張琳;吳玲利;林青;袁軍;呂佳斌;石凱
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明屬于油茶細胞工程領域，具體涉及一種以油茶胚根為外植體誘導不定芽，繼而獲得完整試管苗植株的方法。

背景技術

油茶(Camellia?Oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木，是我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物。茶油不飽和脂肪酸含量達90％以上，色佳味香，風味獨特，營養豐富，耐貯藏，有降血壓、血脂及軟化血管的作用，對心血管疾病的預防有重要作用，是優質的食用油之一，被譽為“東方橄欖油”。同時，油茶副產物還是生產肥料、農藥、栲膠的優質原料。油茶主要分布于我國長江流域以南地區，湖南和江西是油茶主要種植區。目前，中國共有油茶林4531.2萬畝，年產茶油20多萬噸，平均畝產茶油5.8kg，油茶產業普遍存在著單位面積產量低和經濟效益差兩大問題。油茶低產低效的重要原因之一就是良種化程度低，品種混亂，大部分油茶林處于野生狀態，產量較低，良種苗木短缺不能大面積推廣種植。同時，油茶炭疽病Glomerella?cingulata?(Stonem.)Spauld?et?Schrenk是油茶的主要病害。在長江流域以南各省的大面積油茶栽培區，以及河南、陜西南部地區發生普遍。病害發生后，引起嚴重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，嚴重影響了油茶產業的健康發展。通過組織培養可以快速繁殖油茶脫毒苗，在此基礎上通過遺傳體系轉化而獲得抗病植株，在木本油料植物遺傳改良方面有廣闊的前景。

組織培養是快速繁殖優良植物品種的一條重要途徑，具有廣闊的商業化前景。關于油茶組織培養的研究較多，張智俊等人利用油茶無性系子葉通過體細胞胚胎發生途徑獲得了再生植株，李澤等人利用油茶帶芽莖段獲得再生植株，但以上研究只能在油茶組織培養快繁方面有重要意義，不能應用到油茶遺傳體系轉化獲得轉基因植株。植物遺傳體系轉化最常用的方法是農桿菌介導法侵染植物葉片、下胚軸、葉柄、胚根等器官，而油茶葉片誘導不定芽的誘導率僅為17.86％，目前還不能應用在油茶遺傳體系轉發方面，油茶轉基因至今還未找到合適的外植體。本發明通過利用油茶胚根誘導不定芽，再通過不定芽的繼代增殖、生根和煉苗移栽等一系列過程，旨在建立一個高效穩定的油茶胚根離體快繁體系，為油茶快速繁殖及工廠?化育苗奠定基礎。關鍵還在于能夠通過農桿菌浸染實現油茶遺傳轉化的可能性，為油茶快速繁殖及遺傳轉化提供更廣的途徑和技術支撐。

發明內容

本發明的目的是針對目前采用油茶葉片誘導不定芽還未獲得再生植株，油茶轉基因還處于初期探索階段，主要原因是沒有適合油茶遺傳體系轉化的組培體系，在此基礎上，本發明提供了一種油茶胚根誘導不定芽獲得再生植株的方法，該方法利用油茶胚根誘導出不定芽，其誘導率較高，不定芽出芽數較多，繼代增殖系數高，壯苗效果好，生根率高，關鍵還能夠通過農桿菌浸染實現油茶遺傳轉化的可能性。

本發明的目的是通過以下方式實現的。

油茶胚根不定芽誘導獲得再生植株的方法，包括以下步驟:

1)誘導不定芽：在無菌條件下切取長為1.0-1.5cm的油茶無菌苗胚根根段，接種到1/2MS+2.0mg/L?6-BA+0.05-0.1mg/L?IAA+0.05mg/L?IBA+2.0mg/L?GA₃的培養基中誘導不定芽；

2)繼代培養：將胚根誘導的不定芽切下接種到1/2MS+2.0-3.0mg/L?6-BA+0.05-0.1mg/L?IBA+0-1.0mg/L?GA₃的培養基中進行不定芽的繼代培養；

3)壯苗培養：將增殖培養得到的芽轉接到WPM+0.1-1.0mg/L?NAA+3.0-5.0mg/L?GA₃的培養基中進行壯苗培養；

4)生根培養；?

5)煉苗、移栽。?

上述方法中誘導不定芽時暗培養3天后，再到光照條件下培養30-35天。

上述方法中繼代增殖培養時暗培養3天，再到光照條件下培養20-30天。

上述方法中壯苗培養時暗培養2天，再轉到光照條件下培養20-25天。

上述方法中將壯苗培養獲得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/L?IBA+1.0-2.0mg/LNAA+35g/L珍珠巖的培養基中進行生根培養。

上述方法中生根培養時暗培養5天，再轉到光照下培養20天即可生根。?