[發明專利]一種人源堿性成纖維細胞生長因子、煙草葉綠體表達載體及生產方法

有效

• 申請號: 201510310239.3
• 申請日: 2015-06-08
• 公開（公告）號: CN104946656B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 邢少辰;蔡玉紅;王云鵬;韋正乙;仲曉芳;林春晶;張玉英;馬建;劉艷芝;孫卉
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/82;C07K14/50;C07K1/34
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

本發明公開了一種人源堿性成纖維細胞生長因子，該基因序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還公開了一種用于生產人源堿性成纖維細胞生長因子的煙草葉綠體表達載體，命名為pWX?Nt03；本發明還公開了一種攜帶并可擴增上述載體的宿主細胞Mach1；本發明還公開一種利用煙草葉綠體作為生物反應器生產人源堿性成纖維細胞生長的方法；利用葉綠體表達bFGF能夠較傳統的動物血液中分離提取法和現行生物工程制藥中的微生物發酵法不僅大幅度降低成本，且由于植物中往往不含有或極少含有能夠導致人及動物過敏反應的熱源蛋白，因此，相對利用微生物生產bFGF具有更好的臨床應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種人源堿性成纖維細胞生長因子，本發明還涉及一種用于生產人源堿性成纖維細胞生長因子的煙草葉綠體表達載體，本發明還涉及一種攜帶擴增上述的載體的宿主細胞，本發明還涉及一種利用煙草葉綠體作為生物反應器生產人源堿性成纖維細胞生長因子的方法。

背景技術

堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)是FGFs家族中的一員，最初是由牛腦垂體和腦組織提取物中分離得到的一個肝素結合多肽，其等電點為9.6，因為能促進成纖維細胞的分裂增殖而得名。bFGF廣泛分布于中胚層和神經外胚層來源的多種組織和器官，也存在于腫瘤組織中，它具有促進細胞增殖、分化、遷移等多種生物學效應，并參與血管重塑、骨骼形成、神經發育、腫瘤代謝等生理和病理過程。

bFGF作為內源性微量活性物質，在動物組織中含量極微，因此要作為一種產品廣泛應用于臨床，僅依靠傳統的組織提取方法是遠遠不夠的，有必要應用基因工程手段生產。自1986年Abraham等首次克隆了bFGF的cDNA以來，bFGF基因的克隆和表達研究取得了重大的進展，在體內和體外均表現出廣泛的生物學活性。實驗證明，人工重組的bFGF和天然的bFGF有著同樣的生物功能。最近幾年隨著生物工程技術的發展，已能大批量生產重組人bFGF，并在臨床上用于治療某些疾病，諸如：退行性神經系統疾病、腦缺血疾病、冠心病、燒創傷等。

由于葉綠體表達系統具有高效表達外源基因的特點，且其測算的生產成本較傳統的微生物發酵工藝更低廉，因而成為理想的生物反應器平臺。此外，葉綠體基因工程生產的大多數蛋白質可完成二硫鍵交聯、正確折疊等轉錄后修飾，具有正確的空間構象和生物活性，為商業化生產醫用蛋白奠定了理論基礎。Staub等將人源的生長素基因導入煙草葉綠體基因組中,轉基因煙草表達出的人源生長素比核表達系統高300倍,而且具有正常的生物學活性。2004年，Daniell等將胰島素生長因子IGF21基因轉入煙草葉綠體中，得到成熟的IGF21，表達量占可溶蛋白的32％，更重要的是，在葉綠體中表達的IGF21可以形成正確的二硫鍵，而在大腸桿菌中則不能形成。

發明內容

本發明的目的是提供一種人源堿性成纖維細胞生長因子基因，該基因序列如SEQID NO.1所示。

本發明的另一目的是提供一種用于生產人源堿性成纖維細胞生長因子的煙草葉綠體表達載體。

本發明目的通過下述技術方案實現：一種用于生產人源堿性成纖維細胞生長因子的煙草葉綠體表達載體，該載體表達框兩側序列分別為克隆自煙草葉綠體基因組中的部分16S核糖體RNA基因與異亮氨酸轉移RNA基因構成的16S-trnI片段和丙氨酸轉移RNA基因與部分23S核糖體RNA基因構成的trnA-23S片段；在靠近trnA-23S片段的是上述的目的基因bFGF基因，其由葉綠體特異性融合啟動子PrrnPclpPrbcL驅動，并由煙草葉綠體終止子TpsbA終止的表達框；而靠近16S-trnI片段的分別是作為報告基因的綠色熒光蛋白基因GFP和作為篩選標記基因的壯觀霉素抗性基因aadA，依次位于煙草葉綠體啟動子Prrn與煙草葉綠體終止子Trps16之間，構成多順反子的表達框；命名為pWX-Nt03。

本發明的第三目的是提供一種上述的載體的宿主細胞，該宿主細胞命名為Mach1。